Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Покрытие стеклянных покровных стекол поли-L-лизином
- Приготовьте стеклянные покровные стекла путем размораживания 5 мл аликвоты 200 мкг/мл раствора поли-L-лизина (ФАПЧ). Разбавьте этот исходный раствор до 20 мкг/мл, добавив 45 мл чистой инъекционной воды. Отфильтруйте и стерилизуйте раствор в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Пометьте эту пробирку как "PLL Sterile".
заметка: Используйте воду, хранящуюся при комнатной температуре, чтобы ускорить процесс размораживания.
- Добавьте в стерильный раствор ФАПЧ 100 стерильных круглых стеклянных покровных стекол толщиной 12 мм. Помешивайте пробирку каждые 5–10 минут в течение 2–3 минут, чтобы обеспечить равномерное покрытие. Покройте покровные стекла таким образом на 1 ч.<бр/>
заметка: Предпочтение отдается круглым стеклянным покровным стеклам немецкого производства (диаметр = 12 мм), так как они обеспечивают надежную поверхность культивирования и легко помещаются в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток.
- После 40 минут нанесения покрытия PLL возьмите 2 листа папиросной бумаги и положите их в проточный шкаф. Простерилизуйте бумагу с использованием 70% этанола, затем разровняйте, чтобы разгладить складки, и дайте высохнуть.
- После покрытия стеклянных покровных стекол в течение 1 часа ФАПЧ удалите излишки раствора ФАПЧ и добавьте стерильную воду для инъекций. Осторожно перемешивайте покровные стекла в течение 2–3 секунд, чтобы удалить излишки ФАПЧ. Повторите этот этап полоскания еще 2 раза.
- Удалите лишнюю воду, а затем переложите покровные листы на стерильную папиросную бумагу. Аккуратно отделите каждый покровный лист с помощью изогнутых щипцов и дайте высохнуть><.
заметка: Покровные накладки, которые не так легко отделяются, можно выбросить. В качестве альтернативы можно добавить небольшое количество воды, чтобы помочь отделению.
- После высыхания перенесите покровные стекла на 24-луночный планшет для культивирования.
заметка: Покровные листы должны быть готовы примерно за 30–1 час до начала процесса вскрытия. Планшеты можно хранить в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 до тех пор, пока они не потребуются.
2. Диссоциация гиппокампа и корковой ткани
- Приготовление растворов для клеточных культур
- Для диссоциации нервной ткани сначала разморозить 40 мл аликвоты буфера для клеточных культур (состав [в мМ]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,32PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O и 25 D-глюкоза, рН = 7,4). Отмерьте 12 мл буфера для клеточных культур в коническую пробирку объемом 15 мл; как "BSA". Отмерьте 5 мл буфера для клеточных культур в другой пробирке объемом 15 мл; Этикетка как "Papain". Инкубируйте обе пробирки на водяной бане в течение 15 минут при температуре 37 °C.
- Отфильтруйте и стерилизуйте оставшийся буфер для клеточных культур, пометьте его как «Буфер — стерильный» и храните при температуре 4 °C до тех пор, пока не потребуется.
- Взвесьте 120 мг бычьей сыворотки альбумина (BSA) и добавьте в тюбик с маркировкой «BSA». Взвесьте 7 мг папаина и добавьте в пробирку с надписью «папаин». Верните обе трубки на водяную баню на 15 мин.<бр/>
заметка: Полезно добавить небольшое количество буфера в весовую лодку, чтобы облегчить перенос порошка папаина.
- После того, как все порошки растворятся, процедите и стерилизуйте каждый раствор в свежую коническую пробирку объемом 15 мл. Для трубки папаина промаркируйте отфильтрованный раствор как «папаин - стерильный». Для пробирки БСА разделите стерильный раствор БСА на 3 пробирки, каждая из которых содержит 4 мл раствора БСА. Пометьте каждую пробирку как «BSA - Sterile» и «1», «2» или «3». Верните все пробирки обратно на водяную баню и продолжайте инкубировать при температуре 37 °C до тех пор, пока это не потребуется.
- Подготовка к рассечению тканей
- Возьмите один кусок фильтровальной бумаги толщиной 35 мм (см. Таблицу материалов) и простерилизуйте 70% этанолом; оставьте сушиться в крышке чашки Петри диаметром 100 мм в проточном шкафу. Разложите ножницы, щипцы, скальпель и шпатель (см. Таблицу материалов), необходимые для рассечения гиппокампа и коры головного мозга.
- Поместите две чашки Петри диаметром 35 мм и чашку Петри диаметром 100 мм со стерильной фильтровальной бумагой в доступном месте в центре проточной камеры.
- Собрать трансгенный NexCre; Детеныши мышей Ai9 и VGAT Venus, подлежащие препарированию. Используйте люминесцентную лампу с соответствующими фильтрами возбуждения и излучения (см. Таблицу материалов), чтобы отличить флуоресцентных щенков от однопометников дикого типа.
- Непосредственно перед вскрытием животных заполните каждую чашку Петри диаметром 35 мм охлажденным стерильным буфером для клеточных культур.
заметка: Одна чашка Петри предназначена для очистки инструментов между вскрытиями, а другая — для сбора гиппокампа и коры головного мозга.
- Диссекция тканей
- Как только буфер для клеточной культуры будет заполнен, обезглавьте трансгенного мышонка или крысы на 0–2-й день после рождения с помощью больших острых ножниц и с помощью стерильной чашки Петри 100 мм перенесите голову в проточный шкаф. С помощью щипцов, ножниц и шпателя аккуратно перенесите мозг трансгенного щенка на стерильную фильтровальную бумагу.
- Используйте скальпель 22-го типа, чтобы рассечь мозжечок и отделить 2 полушария. С помощью небольшого шпателя скатайте полусферы в сторону. На каждом полушарии слегка надавите, чтобы кора головного мозга соприкоснулась с фильтровальной бумагой. Аккуратно переместите области среднего мозга, чтобы открыть гиппокамп и кору головного мозга.
заметка: Будьте осторожны, не оказывайте слишком большого давления при надавливании на полусферы, иначе клетки могут быть раздавлены.
- Используйте скальпель или шпатель, чтобы отделить гиппокамп и кору головного мозга от каждого полушария. Перенесите рассеченную ткань в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую охлажденный буфер для клеточных культур.
заметка: При препарировании нескольких животных храните стерильный буфер для клеточных культур в конической пробирке объемом 50 мл на льду. После каждого рассечения диссектированную ткань переносят в охлажденный буфер для клеточной культуры.
- После успешного рассечения кортико-гиппокампальной ткани перенесите стерильный раствор папаина из водяной бани в проточный шкаф. С помощью пипетки Пастера объемом 3 мл перенесите рассеченный гиппокамп и кору головного мозга на крышку стерильной чашки Петри диаметром 35 мм. Рубите крест-накрест плоской частью скальпеля типа 22, пока ткань не разделится на мелкие кусочки.
- С помощью небольшого количества раствора папаина переложите измельченную ткань с крышки чашки Петри на стерильную папаинскую трубку. Верните трубку с папаином на водяную баню и инкубируйте ткань при температуре 37 °C в течение 25 минут.
- Во время инкубации папаина составляйте полный раствор флуоресцентной среды. Разморозьте 1 мл аликвоты B27, 0,5 мл аликвоты Glutamax и 0,5 мл аликвоты Pen-Strep. Аликвота 48,5 мл среды Hibernate A с низкой флуоресценцией на коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте в раствор B27, Glutamax и Pen-Strep. Хорошо встряхните раствор, затем профильтруйте и простерилизуйте и пометьте этикеткой «Hibernate A complete media» (с датой и инициалами). Выдерживать при температуре 37 °C на водяной бане.
- После инкубации папаина перенесите трубку с папаином и стерильные трубки BSA в проточный шкаф. С помощью пипетки Пастера объемом 1 мл удалите только кортико-гиппокампальную ткань из папаиновой трубки в BSA-трубку 1,
заметка: Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму перенос излишков раствора папаина.
- Диссоциация клеток
- Чтобы разбить большие комки ткани, растерите ткань несколько раз с помощью пипетки Пастера объемом 1 мл. После этого разотрите ткань 7 раз с помощью пипетки Пастера с тонким наконечником. Дайте салфетке постоять в течение 30 секунд, дав более крупным кусочкам ткани отложиться.
- Через 30 с перенесите нижний 1 мл раствора и ткани из BSA-tube 1 в BSA-tube 2. Измельчите ткань в BSA-трубке 2 несколько раз с помощью пипетки Пастера с тонким наконечником.
- После растирания снова перенесите нижний 1 мл ткани и раствора из BSA-tube 1, но теперь в BSA-tube 3. Растираем ткань в BSA-трубке 3 несколько раз с помощью пипетки Пастера с тонким наконечником.
- После растирания переложите весь раствор и ткань из пробирок 2 и 3 в BSA-пробирку 1. Измельчите еще 2-3 раза и центрифугируйте при 3 000 x g в течение 3 минут.
- Во время центрифугирования заполните полную нейронную базальную среду А (среды NBA). Аквотировать 48,5 мл среды NBA в коническую пробирку объемом 50 мл и инкубировать при 37 °C на водяной бане. Подпишите эту трубку "Только для NBA". Кроме того, разморозьте 1 мл аликвоты B27, 0,5 мл аликвоты Glutamax и 0,5 мл аликвоты Pen-Strep при комнатной температуре.
- После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость из гранулированной ткани и повторно суспендируйте клетки в 2 мл готовой среды. С помощью пипетки P1000 растирайте ткань вверх и вниз 20 раз.
заметка: Следите за тем, чтобы не пипетировать клетки слишком энергично. При слишком сильном давлении клетки могут быть повреждены.
- С помощью пипетки Пастера объемом 1 мл отфильтруйте клеточную суспензию через клеточное сито толщиной 30 мкм в пробирку для образцов из полистирола.
заметка: Если клеточная суспензия не проходит сразу через клеточное сито, может потребоваться надавить на верхнюю часть сита стерильной перчаткой, чтобы запустить поток. Этот важный шаг предотвращает засорение сортировщика клеток.
- Для сбора нейронов после сортировки подготавливают сборные пробирки путем пипетирования 300 мкл готовых сред на необходимое количество полипропиленовых пробирок.
- Теперь суспензия клеток готова к отправке в сортировщик клеток для сортировки. Возьмите клеточную суспензию, дополнительные пробирки для сбора и запасные материалы в сборе на случай, если требуется разбавление пробы.
3. Сортировка очищенных ГАМКергических или глутаматергических нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму вероятность бактериального загрязнения во время сортировки, промойте трубку для образцов сортировщика 70% этанолом в течение как минимум 5 минут перед сортировкой. Подробные параметры сортировки варьируются в зависимости от инструмента, основные соображения заключаются в следующем.
- Во время первой сортировки клеток установите уровни фоновой флуоресценции из немеченых клеток путем сортировки и сравнения клеток животного дикого типа.
- Для каждого типа флуоресцентных ячеек, подлежащих сортировке, выберите соответствующие фильтры возбуждения и излучения. Возбуждайте белки Venus и TdTomato, используя длины волн возбуждения 488 нм или 531 нм соответственно. Обнаружение излучаемого света с помощью наборов фильтров излучения 530/40 и 575/30 соответственно.
- Добавьте полипропиленовые пробирки для сбора, содержащие 300 μл готовой среды, в сортировщик клеток для сбора клеток.
- Для получения высокой чистоты сортируйте ярко помеченные флуоресцентные элементы (см. Рисунок 1B для примера точечных диаграмм отсортированных клеток).
- После сортировки для получения оптимальных результатов проведите тест на чистоту отсортированных ячеек, чтобы оценить уровень чистоты. Обратите внимание, что типичная скорость восстановления клеток после сортировки составляет от 70 до 80%.
- Запишите количество отсортированных клеток в каждой пробирке для сбора. Это значение задается инструментом сортировки ячеек.
заметка: Сортировка ячеек может выполняться с помощью сопла 70 мкм (давление жидкости в оболочке 70 фунтов на квадратный дюйм) или сопла 100 мкм (давление жидкости в оболочке 20 фунтов на квадратный дюйм).
4. Культивирование отсортированных нейронов
- После сортировки клеток перенесите собранные клетки в центрифужные пробирки объемом 2 мл с круглым дном с помощью пипетки Пастера объемом 1 мл. Центрифугируйте клетки при давлении 3 000 x g в течение 3 мин с образованием клеточной гранулы.
заметка: Чтобы помочь определить местоположение клеточной гранулы, ориентируйте пробирки центрифуги с круглым дном шарниром крышки наружу, что позволяет клеточной грануле формироваться на задней стороне центрифужной пробирки (т. е. на той же стороне пробирки, что и шарнир).
- Во время центрифугирования добавьте 1 мл B27, 0,5 мл Glutamax и 0,5 мл Pen-Strep к 48,5 мл предварительно подогретой среды NBA. Хорошо встряхните раствор, затем процеждите, простерилизуйте и пометьте этикеткой «NBA complete media» (с датой и инициалами). Вернитесь на водяную баню до тех пор, пока это не потребуется.
- После центрифугирования используйте пипетку Пастера объемом 1 мл для переноса надосадочной жидкости в другую центрифужную пробирку (сохраните надосадочную жидкость в случае, если клеточная гранула была нарушена). Повторно суспендируйте клеточную гранулу в необходимом количестве предварительно нагретой полной среды NBA для достижения плотности клеток 1000 клеток/мкл. Повторно суспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки P200 или P1000.
- Чтобы подтвердить наличие диссоциированных клеток, проверьте клеточный раствор под микроскопом, используя объектив с 4-кратным или 10-кратным увеличением. В качестве альтернативы можно нанести небольшое количество клеточного раствора на покровную крышку и проверить под микроскопом. Если присутствует большое количество клеток, надосадочная жидкость из шага 4.3 может быть отброшена.
- Перед нанесением покрытия на клетки сделайте вихревую обработку на средней скорости в течение 2–3 с, чтобы обеспечить равномерную суспензию клеток. После вортексирования быстро пипетируйте 10 мкл клеточной суспензии в центр каждого покровного стекла. После пипетирования клеток быстро верните каждую пластину в инкубатор (5% CO2/37 °C) и инкубируйте в течение 1 ч.<бр/>
заметка: При добавлении ячеек к нескольким 24-луночным планшетам обеспечьте равномерную плотность ячеек за счет вихревого расположения ячеек между планшетами.
- Через 1 ч накормите клетки 500 мкл предварительно подогретой полной среды NBA и верните в инкубатор.
заметка: При подаче клеток важно осторожно проводить пипеткой среду вниз по стенке лунки, чтобы избежать отслоения клеток. Для коротких опытов (<16 дней) подкормки при вышеуказанной плотности не нужны. При покрытии большей плотности клеток может потребоваться более частые интервалы кормления.
