Культивирование флуоресцентных возбуждающих нейронов из мозга трансгенного детеныша мыши

Аннотация

Источник: Turko, P., et al. Первичная клеточная культура очищенных ГАМКергических или глутаматергических нейронов, созданная с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. J. Vis. Exp. (2019)

Видео иллюстрирует технику культивирования флуоресцентных ГАМКергических и глутаматергических нейронов из коры и тканей гиппокампа трансгенных мышиных детенышей. Процесс включает в себя получение очищенных одиночных клеточных суспензий нейронов, сортировку ГАМКергических нейронов на основе их экспрессии флуоресцентных белков и засеивание их на пластины, покрытые поли-L-лизином, для облегчения прикрепления и пролиферации клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Покрытие стеклянных покровных стекол поли-L-лизином

1. Приготовьте стеклянные покровные стекла путем размораживания 5 мл аликвоты 200 мкг/мл раствора поли-L-лизина (ФАПЧ). Разбавьте этот исходный раствор до 20 мкг/мл, добавив 45 мл чистой инъекционной воды. Отфильтруйте и стерилизуйте раствор в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Пометьте эту пробирку как "PLL Sterile".
   заметка: Используйте воду, хранящуюся при комнатной температуре, чтобы ускорить процесс размораживания.
....

Результаты

Рисунок 1: Очищение глутаматергических и ГАМКергических нейронов. (A) Изображения, показывающие флуоресцентный сигнал от экспрессии трансгена TdTomato в NexCre; Мыши Ai9 (вверху) и Venus у мышей VGAT Venus (внизу). Масштабные линейки = 5 мм. (B) Графики интенсивности рассеяния флуоресценции TdTomato и Venus кортико-гиппокампальных диссоциированных клеток NexCre; мыши.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нейронная базальная среда А (НБА)	ThermoFisher Scientific	10888022	Буфер для клеточных культур
В27	ThermoFisher Scientific	17504001	Культуральная добавка
Глутамакс	ThermoFisher Scientific	35050-038 (Английский)	Культуральная добавка
Пенициллин стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	ThermoFisher Scientific	15140-122	антибиотик
Поли-L-лизин	сигма	П1399	Покровное покрытие
папаин	сигма	П4762-1Г	фермент
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А3294-100Г	сыворотка
Гибернация Среда с низкой флуоресценцией	ООО «Брейн Битс»	половина	Среды для транспортировки клеток
Пипетка Пастера с тонким наконечником	Нео Лабс	- T	Используется для растирания клеток
24-луночные планшеты	БД	353047	Культуральная пластина
Пробирки Falcon 50 мл	БД	No 352070 (Английский	- T
Пробирки Falcon 15 мл	БД	352096	- T
Стеклянные покровные стекла: круглые 12 мм	Рот	П231.1	- T
Чашка Петри 35 мм	Корнинг	353001	- T
Чашка Петри 100 мм	Корнинг	353003	- T
Клеточное сито CellTrics 30 μм	Sysmex	04-004-2326 (Английский	Для удаления клеточных комков перед сортировкой клеток
Трубки из полистирола с круглым дном	БД	352054	Транспортировочная трубка для отсортированных клеток
Полипропилиновые трубки с круглым дном	БД	352063	Сборная пробирка для отсортированных клеток
Сверхтонкие боннские ножницы	Точные научные инструменты	14084-08	Для удаления вышележащей кожи и костей мышей
Очень узкие ножницы	Точные научные инструменты	14088-10	Для удаления вышележащей кожи и костей крыс
щипцы	Точные научные инструменты	11242-40	Удержание головы на месте
Шпатель (длина 130 мм / ширина наконечника 5 мм)	Точные научные инструменты	3006.1 Материал 3006.1	Для удаления мозга отфильтровать бумагу
Лезвия скальпеля	Суон-Мортон	#0308	Для механической диссоциации нервной ткани
Гемоцитометр (Neubauer Imroved)	Оптик Труд	- T	Подсчет диссоциированных клеток

) )