1. Подготовка среды
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол основан на использовании комбинации двух отдельных сред: DMEM/F12 с модифицированной добавкой N2 и Neurobasal с добавкой B27, обычно в соотношении 1:1.
- Приготовьте модифицированную добавку N2, смешав компоненты в пробирке объемом 15 мл. Не делайте это вихревыми и не фильтруйте их; Перемешивайте, переворачивая трубку до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
- Начните с пипетирования 7,2 мл DMEM/F12, затем добавьте 1 мл инсулина 25 мг/мл (состоящего из 0,01 М HCl) и хорошо перемешайте, перевернув трубку. Проходит пара минут, пока раствор не станет прозрачным.
- Добавьте 1 мл 100 мг/мл апотрансферрина (в воде), 33 мкл 0,6 мг/мл прогестернона (в составе этанола), 100 мкл 160 мг/мл (1 М) путресцина (в воде), 10 мкл 3 мл селенита натрия (в воде) и 666 мкл 7,5% бычьего сывороточного альбумина и хорошо перемешайте в пробирке. Разложите по 2,5 мл и храните при температуре -20 °C до 2 месяцев.
- Подготовьте носитель.
- К 250 мл DMEM/F12 добавьте 2,5 мл N2. Хорошо перемешайте, но не встряхивайте и не фильтруйте.
- К 250 мл нейробазальной среды добавьте 5 мл добавки В27. Хорошо перемешайте, но не встряхивайте и не фильтруйте.
- Смешайте среды, указанные на шагах 1.2.1 и 1.2.2, в соотношении 1:1. В некоторых случаях может потребоваться смесь 1:3 (дополненная как смесь 1:1 на шаге 1.2.4).
- В смесь добавить 0,5 мл L-глютамина (конечная концентрация 0,2 мМ) и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола (конечная концентрация 0,1 мМ) и хорошо перемешать, не встряхивая. Храните фильтрующий материал при температуре 4 °C до 3 недель и избегайте воздействия света. Эта финальная смесь называется N2B27.
- Приготовьте желатиновый раствор.
- Приготовьте 1% раствор желатина в сверхчистой воде и автоклавируйте при температуре 121 °C, 15 фунтов на квадратный дюйм, в течение 15 минут. Важно, чтобы используемая для этого бутылка была полностью чистой от моющих или дезинфицирующих средств, поэтому рекомендуется использовать для этого новую бутылку и ополаскивать ее в сверхчистой воде только между использованиями. Разложите 1% раствор на 50 мл и держите при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.
- Нагрейте аликвоту 1% желатина на водяной бане при температуре 37 °C до полного растворения и добавьте к 500 мл теплого фосфатно-солевого буфера (PBS). Хорошо перемешайте и пипеткой достаточно накрыть дно каждой лунки или тарелки. Дайте желатину покрыть поверхность не менее 30 минут.
2. Покрытие ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол в равной степени применим к мышиным ESC, выращенным в 10% сыворотке с фактором ингибирования лейкемии (LIF), замене сыворотки с LIF или бессывороточной среде с LIF и костным морфогенетическим белком 4 (BMP4) или ингибиторами MEK и GSK3 (2i среда) с LIF или без него. Однако сроки и эффективность дифференцировки могут варьироваться в зависимости от среды и клеток. Для показанных здесь экспериментов мы использовали мышиную линию ESC 46C (с репортером EGFP, вбитым в один из эндогенных аллелей Sox1), выращенную в GMEM с 10% сывороткой и LIF. Для достижения оптимальных результатов важно, чтобы клетки были диссоциированы и реплацированы в среде N2B27; Простая смена среды с GMEM/сыворотки/LIF на N2B27 всегда приводит к снижению эффективности дифференцировки по сравнению с повторным покрытием клеток.
- Выращивайте клетки в GMEM с 10% сывороткой, 1 мМ пирувата натрия, 1x заменимыми аминокислотами, 0,1 М 2-меркаптоэтанола и 100 единиц/мл LIF13. Чтобы получить субконфлюентную культуру мышиной ЭСК, поместите 1 х 106 клеток в колбу для культуры Т25, что займет 2 - 3 дня.
- Наблюдайте за клетками под светлопольным микроскопом. Когда клетки подсоединится и будут готовы к прохождению, дважды промойте их в PBS. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток и верните в инкубатор на 2 - 5 минут. Хотя трипсин и другие ферменты также могут быть использованы для диссоциации клеток, они могут негативно влиять на прикрепление клеток, поэтому плотность покрытия необходимо будет регулировать.
- Как только клетки начнут отрываться от пластины, постучите по сосуду, чтобы вытеснить их в одноклеточную суспензию. Соберите клетки в 10 мл среды и реагента для диссоциации клеток и пипетируйте в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Вращайте ячейки при 300 x g в течение 3 минут при RT.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 10 мл предварительно подогретого N2B27 путем пипетирования вверх и вниз 3 - 5 раз. При пипетировании суспензии вниз пипетируйте к боковой стороне трубки, чтобы избежать образования пузырьков. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и запишите концентрацию.
- Приготовьте суспензию ячеек, содержащую желаемое количество ячеек на единицу объема, которую нужно покрыть на лунку в предварительно нагретом N2B27. Оптимальной является плотность 10 500 клеток насм2 в 6-луночной чашке (т.е. 1 x 105 клеток на лунку 6-луночной чашки). В таблице 1 приведено рекомендуемое количество клеток насм2 и объемы плоских сред для различных сосудов для клеточных культур.
- Отсадите желатин из питательного сосуда и нанесите клеточную суспензию в соответствии с предложенной плотностью и объемом в таблице 1. Не закручивайте пластины, так как это сконцентрирует клетки к центру. Поместите культуры во влажный инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2.
- Меняйте носители каждые 1 - 2 дня, заменяя все носители на свежие N2B27. Делайте пипетку осторожно, так как промывка клеток может повлиять на плотность и снизить эффективность дифференцировки в последующие дни. Если исходная жизнеспособность после нанесения плохая, поместите клетки в смесь N2 и B27 в соотношении 1:3 и измените ее на N2B27 после первых двух дней. Клетки начнут дифференцироваться и должны проявить экспрессию Sox1 (видимую по зеленой флуоресценции репортера в используемой здесь клеточной линии 46C) в течение 4-6 дней.
Таблица 1. Предложены плотности гальванических покрытий и объемы сред для сосудов различных размеров. Плотности покрытия в этой таблице определяли с помощью клеточной линии 46C. Для достижения оптимальных результатов может потребоваться регулировка плотности покрытия каждой отдельной линии.
| платформа | Диапазон эффективной плотности (ячейки/см2) | Диапазон номера ячейки до номерного знака | Рекомендуемый исходный объем среды (μл) | Рекомендуемый объем среды после 1-го дня (мкл) |
| 6-луночный планшет | 10 500 - 36 500 | 99,750 - 346,750 | 1 000 | 2 000 |
| 24-луночный планшет | 15,600 - 46,800 | 29 640 - 88 920 | 500 | 1 000 |
| 96-луночный планшет | 103,500 - 260,000 | 33,120 - 83,200 | 100 | 200 |
