$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Дифференциация HNSC на трехмерной (3D) культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделите и получите человеческие нейрональные стволовые клетки (hNSC) из этически одобренной ткани, описанной в предыдущей публикации. Пожалуйста, следуйте этическим и институциональным принципам при выполнении этой процедуры.
- 3D-культивирование с использованием 12-луночного планшета
- Используйте асептическую технику на протяжении всей процедуры. В шкафу биологической безопасности регидратируйте каркасы, добавив 2 мл на лунку 70% этанола, приготовленного с использованием воды для орошения (WFIr). Избегайте прикосновения к каркасам, выдавая 70% этанол по стенке каждого колодца.
- Осторожно отасуньте 70% этанол и немедленно промойте каркасы 2 мл/лунка Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) в течение 1 мин. Повторите процедуру промывки дважды. Осторожно отсасывайте DMEM: F12 после окончательной промывки.
- Покрывайте каркасы, добавляя 2 мл/лунку ламинина (10 мкг/мл) в DMEM: F12. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% содержаниемCO2 не менее 2 часов. Вымойте тарелку теплым DMEM:F12.
- Засейте каждый каркас примерно 500 000 гНСК в объеме 150 мкл RMM+факторы роста (GF).
- Инкубируйте планшет в течение 3 часов при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% содержаниемCO2, чтобы клетки могли осесть в каркасах.
- Добавьте по 3,5 мл РММ в каждую лунку, стараясь не выбить ячейки из каркасов.
- Инкубируйте тарелку в течение 7 дней; замените среду RMM (3,5 мл/лунку) через 1 день (первое кормление) и повторно через 2-3 дня от первого кормления.