1. Настройка для покрытия посуды, подготовки среды и обслуживания hPSC
- Покрытие посуды
- Покрытие с помощью витронектина (VTN)
- Поместите флаконы с VTN на водяную баню при температуре 37 °C до полного оттаивания, затем тщательно перемешайте.
- Для чашки Петри диаметром 100 мм смешайте 7 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) с 0,5 мг/мл VTN, добавьте раствор VTN в чашку и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа.
- Матричное покрытие базальной мембраны
- Пробирки матрицы базальной мембраны (см. Таблицу материалов) разморозить на льду при температуре 4 °С в течение ночи.
- Для одной лунки из 6-луночной тарелки смешайте 2 мл модифицированной смеси Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco с 20 μL 100x матрицы базальной мембраны, добавьте раствор матрицы базальной мембраны в чашку, оберните чашку парафиновой пленкой и храните в чистом контейнере при температуре 4 °C в течение ночи. Работайте как можно быстрее. Посуда с покрытием может храниться при температуре 4 °C до 2 недель.
- Покрытие из полиорнитина (PO)/ламинина (LM)/фибронектина (FN)
- В первый день для одной лунки из 24-луночного планшета смешайте 15 мкг/мл перорально с 1 мл 1x PBS, инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение ночи. Разморозьте LM и FN при -20 °C в течение ночи и храните при 4 °C до полного оттаивания.
- На второй день аспирируйте раствор ПО, промойте лунки 2x 1x PBS, добавьте 1 мл 1x PBS, содержащего 2 мкг/мл LM и 2 мкг/мл FN и инкубируйте при 37 °C в 5% CO2 в течение ночи. На этом этапе чашку с раствором LM/FN можно держать в инкубаторе месяцами, пока она не высохнет. Добавьте еще 1x PBS, чтобы блюдо не высохло.
- Подготовка СМИ
- Приготовьте среду Essential 8 (E8), разморозив одну бутылку добавки E8 при 4 °C на ночь. Смешайте добавку с 500 мл среды E8 и антибиотиками при необходимости.
заметка: Рабочий раствор Е8 должен быть израсходован в течение 2 недель.
- Приготовьте замораживающую среду hPSC путем смешивания 90 мл полной среды E8 с 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в общем объеме 100 мл. Фильтр простерилизовать.
- Приготовьте среду для дифференцировки с 0 по 1 день, смешав 100 мл эфирной среды 6 (Е6) с 10 мкМ SB431542, 1 нг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP4), 300 нМ CHIR99021 и 10 мкМ Y27632 для получения общего объема 100 мл.
- Приготовьте среду для дифференцировки со 2-го по 10-й день, смешав 100 мл среды Е6 с 10 мкМ SB и 0,75 мкМ CHIR99021 общим объемом 100 мл.
- Приготовьте сфероидную среду с 10 по 14 день, смешав нейробазальную среду с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 mM L-глутамата, 3 μM CHIR99021 и 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2 (FGF2) в общем объеме 100 мл.
- Подготовьте среду с 14 по 28 день для долгосрочного содержания сфероида, добавив 0,5 мкМ свежей ретиноевой кислоты (RA) в сфероидную среду с 10 по 14 день для каждого кормления><.
заметка: Всегда держите РА на уровне -80 °C.
- Приготовьте среду для созревания SymN, смешав нейробазальную среду с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 мМ L-глутамата, 25 нг/мл нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF), 25 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF), 25 нг/мл фактора роста нервов (NGF), 200 мкМ аскорбиновой кислоты и 0,2 мМ дибутирилциклического аденозинмонофосфата (dbcAMP) в общем объеме 100 мл. Раствор следует использовать в течение 2 недель. Перед каждой подкормкой добавляйте 0,125 мкМ свежего РА. Это решение используется с 14 дня (вариант 1) или 28 дня (вариант 2).
- Приготовьте буфер для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), смешав DMEM с 2% FBS, 2 мМ L-глутаматом и антибиотиками, если это необходимо, в общем объеме 100 мл.
- Техническое обслуживание hPSC
- Размораживание и поддержание hPSCs
- Подготовьте одну посуду с покрытием VTN 100 мм.
- Чтобы разморозить флакон с hPSCs непосредственно из жидкого азота, поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C, осторожно покачивая пробирку в воде до тех пор, пока она не оттает. Перенесите размороженные hPSCs в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в пробирку 1 мл среды Е8. Сделайте пипетку несколько раз, чтобы полностью суспендировать гранулу, а затем добавьте еще 9 мл среды E8, чтобы достичь общего количества 10 мл.
- Отсасывайте раствор VTN из 100-миллиметровой чашки.
- Переложите hPSCs в чашку диаметром 100 мм, осторожно встряхните (вверх-вниз и влево-вправо, не по кругу), чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены в чашке
- Инкубировать при 37 °C, при 5%CO2.
- На следующий день отсадите всю среду и накормите 10 мл Е8.
- Кормите таким образом каждый день в течение следующих 3–4 дней, а затем приготовьтесь к разделению.
- Расщепление hPSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs в точке расщепления должен быть на 80%–90% слитым. Следует наблюдать большие колонии с гладкими и яркими краями. Тем не менее, следует избегать контакта между каждой колонией (Рисунок 1B, день 0 и Рисунок 4B).
- При необходимости приготовьте посуду 100 мм с покрытием VTN.
- Отсадите Е8 и вымойте посуду, которую нужно разделить 1x с 1x PBS.
- Аспирируйте 1x PBS и добавьте 4 мл 0,25 М ЭДТА. Инкубировать в течение 2 мин при 37 °C, 5% CO2,
заметка: ПСК должны быть разделены/повторно покрыты небольшими колониями. Не обрабатывайте этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) дольше 2 минут, чтобы предотвратить разделение на отдельные клетки. Клетки должны оставаться прикрепленными к поверхности посуды после 2-минутной обработки.
- Аспирируйте ЭДТА, отделите колонии, сильно пипетируя 10 мл среды Е8 на поверхность чашки, и соберите всю среду и клетки в пробирку объемом 15 мл.
- При слиянии hPSCs на 80%–90% колонии разделяются в соотношении 1:15–1:20. Например, чтобы разделить hPSCs в соотношении 1:20 на одну чашку 100 мм, возьмите 500 μL раствора E8/hPSCs и смешайте с 9,5 мл свежей среды E8.
- Пластинчатые ПСК в посуде 100 мм с покрытием VTN.<бр/>
заметка: Рекомендуется устанавливать идеальное соотношение расщепления для каждого исследователя и клеточной линии независимо друг от друга.
- Замораживание hPSCs
- Для одной 100 мм чашки с hPSCs, готовой к расщеплению, приготовьте три криовалиала и 3,5 мл замораживающей среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среду и флаконы следует хранить при температуре 4 °C или на льду до использования.
- Отсадите Е8 и вымойте посуду 2x с 1x PBS.
- Аспирируйте 1x PBS и добавьте 4 мл 0,25 М ЭДТА, инкубируйте 2 минуты при 37 °C, в 5% CO2,
ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть заморожены в виде небольших колоний в момент их разделения. Не обрабатывайте клетки ЭДТА дольше 2 минут, чтобы предотвратить разделение на отдельные клетки. Клетки должны оставаться на поверхности посуды после 2-минутной обработки.
- Аспирируйте ЭДТА, отделите колонии, сильно пипетируя 10 мл 1x PBS на поверхность чашки, и соберите всю среду и клетки в пробирке объемом 50 мл.
- Добавьте 20 мл 1x PBS и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут, чтобы смыть остатки ЭДТА.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл замораживающей среды.
- Равномерно распределите hPSCs по трем криовиалам по 1 мл каждому.
- Хранить при температуре -80 °C в течение ночи в контролируемой морозильной камере или бутерброде из пенополистирола для обеспечения медленного перепада температуры, а затем переложить в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.
2. Посев hPSC для начала дифференцировки (день 0)
ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть готовы к дифференцировке после стабилизации (т.е. расщепления в 2–3 раза после размораживания). Убедитесь, что колонии здоровые, с гладкими, блестящими краями и минимальной дифференцировкой (рисунок 2B).
- При необходимости приготовьте посуду с матричным покрытием из базальной мембраны (24 лунки или 6 лунок) за день до дня 0. Принесите блюда в RT в начале дифференциации.
- При необходимости сделайте среду для дифференцировки за день 0–1.
- Отберите Е8 из слива, готового к расщеплению hPCS, и вымойте посуду 2x с 1x PBS.
- Добавьте 7 мл 0,25 М ЭДТА на 100 мм чашку, инкубируйте при 37 °C, 5%CO2, в течение 15 мин.<бр/>
заметка: На этом этапе лечение ЭДТА удлиняется до рассредоточения на отдельные клетки.
- Отпишьте от всех ПСК (они должны быть плавающими) и переложите в пробирку объемом 50 мл. Добавьте такое же количество или больше 1x PBS в качестве раствора ЭДТА, чтобы разбавить ЭДТА.
- Центрифугируйте при 200 х г в течение 4 мин.
- Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 1 мл среды для дифференцировки 0–1 дня и пипетируйте для гомогенизации клеток. Затем добавьте еще среды, а затем перемешайте, чтобы разбавить клеточный раствор до концентрации, идеальной для подсчета клеток.
заметка: Не стоит чрезмерно разбавлять клеточный раствор. Для начала ячейки из одной полной чашки 100 мм следует развести в 5 мл среды.
- Подсчитайте количество клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
- Раствор клетки разбавляют по мере необходимости, чтобы достичь 125 000 клеток/см2 при низком конечном объеме (например, 2 мл на лунку для чашки на 6 лунок или 500 мкл на лунку для чашки на 24 лунки).
заметка: Небольшой объем помогает клеткам прикрепляться быстрее.
- Отасуньте весь раствор матрицы базальной мембраны из посуды с покрытием и поместите раствор ячейки в лунки.
- Инкубировать при 37 °C, при 5%CO2.
3. Индукция клеток нервного гребня (день с 1 по 10, рисунок 1A)
- В 1-й день подкармливайте клетки средой для дифференцировки 0–1-го дня (3 мл на лунку для 6 лунок и 1 мл на лунку для 24 луночных посуды).
- На 2-й день кормят клетки средой для дифференцировки со 2 по 10 день (3 мл на лунку для 6 лунок и 1 мл на лунку для 24 луночных посуды).
- С этого момента клетки следует кормить через день до 10 дня (т.е. следующим днем кормления будет 4 день).
заметка: Начиная с 6-го дня следует обнаруживать NC-гребни (Рисунок 1B). Чтобы проверить, происходит ли дифференцировка, рекомендуется проводить параллельную дифференцировочную культуру в небольших лунках (т.е. в 24 лунках), которые могут быть окрашены на SOX10/AP2a и использоваться для экспрессии маркерных генов во время дифференцировки (рис. 1B, C).
- Если вы сортируете ячейки, перейдите к разделу 4. В противном случае перейдите к разделу 5.
4. Флуоресцентная сортировка активированных клеток (FACS) для маркера нервного гребня CD49D и агрегация NC-клеток в сфероидах
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сортировки FACS образцы должны храниться на льду и не подвергаться воздействию света после окрашивания до сортировки.
- Подготовьте буфер FACS, если ячейки отсортированы.
- Готовят на 10–14 день сфероидную среду.
- На 10-й день удалите среду и промойте 1x с 1x PBS.
- Добавьте раствор диссоциации (см. Таблицу материалов) из расчета 2 мл на лунку для чашки на 6 лунок или 1 мл на лунку для чашки на 24 лунки и инкубируйте при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение 20 минут.
- Отпишьте все ПСК и переложите в трубку объемом 50 мл.
- Заполните оставшуюся часть пробирки буфером FACS и центрифугируйте при давлении 200 x g в течение 4 мин.<бр/>
заметка: Каждая пробирка объемом 50 мл может вместить до 20 мл или менее клеточного раствора. Объем буфера FACS должен быть достаточно высоким для нейтрализации диссоциативного раствора.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки с соответствующим количеством буфера FACS (~2 мл на лунку 6-луночного планшета) и посчитайте, чтобы определить номер клетки.
- Подготовьте следующие образцы.
- Образец 1 (неокрашенный контроль): 1 x 106 клеток в 400 мкл буфера FACS. Отфильтруйте ячейки через крышку ситечка 20 мкм и держите пробирку на льду.
- Образец 2 (только контроль DAPI): 1 x 106 клеток в 400 мкл буфера FACS, содержащего 0,5 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Отфильтруйте клетки через трубку FACS с крышкой от фильтра и держите трубку на льду.
- Образец 3 (меченый CD49D): Суспензируйте остальные клетки буфером FACS, содержащим антитело CD49D, конъюгированное с фикоэритрином/цианином7 (PE/Cy7) (5 мкл для 1 x 106 клеток на 100 мкл буфера FACS) в пробирке объемом 15 мл и инкубируйте на льду в течение 20 минут.
- Заполните пробирки буфером FACS и центрифугируйте при давлении 200 x g в течение 4 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждые 5–10 x10 6 клеток в 1 мл буфера FACS, содержащего 0,5 мкг/мл DAPI в соответствии с инструкциями производителя.
- Отфильтруйте ячейки через трубку FACS с помощью крышки фильтра и держите трубку на льду.
- Подготовьте пробирки для сбора FACS, содержащие 2 мл буфера FACS.
- Отсортируйте устройство FACS с помощью лазеров, которые могут обнаруживать DAPI и PE-Cy7, чтобы изолировать популяцию CD49D+.
- После сортировки подсчитайте отсортированные ячейки.
- Центрифугируют все отсортированные клетки и ресуспендируют на 10–14-е сутки сфероидную среду до конечной концентрации 0,5 х 106 клеток на 500 мкл среды.
- Планшет 0,5 x 106 ячеек на лунку в сверхнизкое прикрепление 24 луночных планшета.
- Инкубируйте клетки при 37 °C, в 5%CO2.
5. Агрегирование NC-клеток в сфероидах
- Если вы не используете FACS для выделения НК-клеток, а вместо этого агрегируете их непосредственно в сфероиды, сначала подготовьте клетки, как описано в шагах 4.2–4.5.
- Заполните оставшуюся часть пробирки 1x PBS и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки соответствующим количеством сфероидной среды на 10–14-й день (например, ~2 мл среды на лунку для 6-луночного планшета) и посчитайте, чтобы определить количество клеток.
- Разбавляют клетки в сфероидной среде на 10–14-й день до 0,5 х 106 клеток на 500 мкл среды.
- Планшет 500 мкл клеточной суспензии на лунку в сверхнизком присоединении 24 луночных планшета.
- Инкубируйте клетки при 37 °C, в 5%CO2.
6. Поддержание сфероида НЗ и индукция симпатического предшественника (день с 10 по 14, рисунок 3A)
- Вариант 1: Минимальное культивирование сфероидов
- На 11-й день добавьте 500 мкл сфероидной среды 10–14-го дня к сфероидам НК без аспирации существующей среды с 10-го дня. Инкубировать при 37 °C, при 5%CO2.
- На 12-й день наклоните пластину, чтобы накопить сфероиды NC с одной стороны лунок. Осторожно отсасывайте и отбрасывайте как можно больше среды, а также скармливайте 1 мл 10–14 дня сфероидной среды.
- Продолжайте кормить клетки каждый день до 14 дня.
- Дополнительно: Если сфероиды агрегируются и образуют большой комок, используйте пипетку, чтобы разбить сфероидные комки. Это также гарантирует, что отдельные сфероиды не станут слишком большими.
заметка: Идеальный диапазон размеров сфероидов должен составлять около 100–500 мкм. В пределах этого диапазона размер отдельных сфероидов не имеет критического значения. Тем не менее, морфология, такая как гладкие и четкие края (Рисунок 2 и Рисунок 4), важна для дальнейшего успеха. На 14-й день каждый 24-луночный планшет в идеале содержит около 50–60 сфероидов разных размеров в указанном диапазоне размеров.
- Вариант 2: Расширенная культура сфероидов
- На 15-е сутки для содержания сфероидов НК скармливают 1,5 мл сфероидной среды 10–14-го дня, содержащей 0,5 мкМ РА. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2,
заметка: РА следует добавлять в свежем виде при каждом кормлении и всегда хранить при температуре -80 °C.
- С этого момента подкармливайте через день до 28 дня и далее продолжайте обработку сфероидов (раздел 7.1).
заметка: Растущие сфероиды расщепляют примерно 1 раз в неделю путем пипетирования с помощью пипетки объемом 1 мл для их разделения. Они расщепляются в примерном соотношении 1:2–1:4. В течение 2-недельного периода расширения количество клеток должно увеличиться примерно в четыре раза.
7. Дифференцировка и созревание симпатических нейронов (SymN) (Вариант 1: после 14 дня; Вариант 2: после 28 дня)
- Гальванизация сфероидов в обычную посуду
- Подготовьте 24-луночные планшеты с покрытием PO/LM/FM.
- Приготовьте среду symN, содержащую 0,125 мкМ РА (добавляйте свежую каждую подкормку) и 10 мкМ Y27632 (только на 14-й день).
- На 14-й день наклоните пластину, чтобы накопить НК сфероиды с одной стороны лунок. Тщательно аспирируйте и выбросьте как можно больше среды, а также накормите 1 мл среды symN.
- Снимите LM/FN с пластин с покрытием.
- Разделите и профилируйте каждую лунку из 24-луночной пластины в 4 отдельные лунки новой, покрытой 24-луночной пластиной. Каждая исходная лунка будет иметь 1 мл, содержащий ~50–60 сфероидов. Это дает 250 μл, содержащих примерно 10–15 сфероидов для каждой лунки на новой пластине.
- Добавьте 250 мкл дополнительной среды на лунку.<бр/>
заметка: Это разделение 1:4; Убедитесь, что сфероиды правильно распределены внутри раствора, чтобы расщепление было относительно равномерным. Количество сфероидов не учитывается, так как итоговое число не влияет на успешность генерации символов.
- Инкубировать при 37 °C, 5%CO2.
- На 15-й день (или на 29-й день для варианта 2) кормят, заменив всю среду на 1 мл среды symN, содержащей 0,125 мкМ РА. С этого момента нейроны следует кормить каждые 2 дня до 20 дня (или 35 дня для варианта 2).
- После 20-го дня (или 35-го дня для варианта 2) нейроны следует подкармливать, осторожно заменяя только половину имеющейся среды (500 мкл). С этого момента подкармливайте каждую неделю, если среда быстро не пожелтеет.
- Продолжайте кормление еженедельно до желаемого момента времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: символы имеют тенденцию агрегироваться в ганглиевидные структуры и склонны отделяться от питательных чашек. Чтобы предотвратить это, рекомендуется полукормление и минимальное обращение.
