Методическая статья

Генерация постганглионарных симпатических нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Wu, H. F., et al. Эффективная дифференцировка постганглионарных симпатических нейронов с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека в условиях культивирования без питательных веществ и с определенным химическим составом. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует метод in vitro для генерации постганглионарных симпатических нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). hPSCs дифференцируются в клетки нервного гребня (NCCs) на основе матрицы базальной мембраны с использованием среды для дифференцировки. Затем НКК диссоциируются и формируются в сфероиды с использованием другой среды для дифференцировки. Наконец, сфероиды трансформируются в постганглионарные симпатические нейроны с использованием среды симпатических нейронов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Настройка для покрытия посуды, подготовки среды и обслуживания hPSC

  1. Покрытие посуды
    1. Покрытие с помощью витронектина (VTN)
      1. Поместите флаконы с VTN на водяную баню при температуре 37 °C до полного оттаивания, затем тщательно перемешайте.
      2. Для чашки Петри диаметром 100 мм смешайте 7 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) с 0,5 мг/мл VTN, добавьте раствор VTN в чашку и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа.
    2. Матричное покрытие базальной мембраны
      1. Пробирки матрицы базальной мембраны (см. Таблицу материалов) разморозить на льду при температуре 4 °С в течение ночи.
      2. Для одной лунки из 6-луночной тарелки смешайте 2 мл модифицированной смеси Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco с 20 μL 100x матрицы базальной мембраны, добавьте раствор матрицы базальной мембраны в чашку, оберните чашку парафиновой пленкой и храните в чистом контейнере при температуре 4 °C в течение ночи. Работайте как можно быстрее. Посуда с покрытием может храниться при температуре 4 °C до 2 недель.
    3. Покрытие из полиорнитина (PO)/ламинина (LM)/фибронектина (FN)
      1. В первый день для одной лунки из 24-луночного планшета смешайте 15 мкг/мл перорально с 1 мл 1x PBS, инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение ночи. Разморозьте LM и FN при -20 °C в течение ночи и храните при 4 °C до полного оттаивания.
      2. На второй день аспирируйте раствор ПО, промойте лунки 2x 1x PBS, добавьте 1 мл 1x PBS, содержащего 2 мкг/мл LM и 2 мкг/мл FN и инкубируйте при 37 °C в 5% CO2 в течение ночи. На этом этапе чашку с раствором LM/FN можно держать в инкубаторе месяцами, пока она не высохнет. Добавьте еще 1x PBS, чтобы блюдо не высохло.
  2. Подготовка СМИ
    1. Приготовьте среду Essential 8 (E8), разморозив одну бутылку добавки E8 при 4 °C на ночь. Смешайте добавку с 500 мл среды E8 и антибиотиками при необходимости.
      заметка: Рабочий раствор Е8 должен быть израсходован в течение 2 недель.
    2. Приготовьте замораживающую среду hPSC путем смешивания 90 мл полной среды E8 с 10 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в общем объеме 100 мл. Фильтр простерилизовать.
    3. Приготовьте среду для дифференцировки с 0 по 1 день, смешав 100 мл эфирной среды 6 (Е6) с 10 мкМ SB431542, 1 нг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP4), 300 нМ CHIR99021 и 10 мкМ Y27632 для получения общего объема 100 мл.
    4. Приготовьте среду для дифференцировки со 2-го по 10-й день, смешав 100 мл среды Е6 с 10 мкМ SB и 0,75 мкМ CHIR99021 общим объемом 100 мл.
    5. Приготовьте сфероидную среду с 10 по 14 день, смешав нейробазальную среду с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 mM L-глутамата, 3 μM CHIR99021 и 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2 (FGF2) в общем объеме 100 мл.
    6. Подготовьте среду с 14 по 28 день для долгосрочного содержания сфероида, добавив 0,5 мкМ свежей ретиноевой кислоты (RA) в сфероидную среду с 10 по 14 день для каждого кормления><. заметка: Всегда держите РА на уровне -80 °C.
    7. Приготовьте среду для созревания SymN, смешав нейробазальную среду с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 мМ L-глутамата, 25 нг/мл нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF), 25 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF), 25 нг/мл фактора роста нервов (NGF), 200 мкМ аскорбиновой кислоты и 0,2 мМ дибутирилциклического аденозинмонофосфата (dbcAMP) в общем объеме 100 мл. Раствор следует использовать в течение 2 недель. Перед каждой подкормкой добавляйте 0,125 мкМ свежего РА. Это решение используется с 14 дня (вариант 1) или 28 дня (вариант 2).
    8. Приготовьте буфер для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), смешав DMEM с 2% FBS, 2 мМ L-глутаматом и антибиотиками, если это необходимо, в общем объеме 100 мл.
  3. Техническое обслуживание hPSC
    1. Размораживание и поддержание hPSCs
      1. Подготовьте одну посуду с покрытием VTN 100 мм.
      2. Чтобы разморозить флакон с hPSCs непосредственно из жидкого азота, поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C, осторожно покачивая пробирку в воде до тех пор, пока она не оттает. Перенесите размороженные hPSCs в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут.
      3. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в пробирку 1 мл среды Е8. Сделайте пипетку несколько раз, чтобы полностью суспендировать гранулу, а затем добавьте еще 9 мл среды E8, чтобы достичь общего количества 10 мл.
      4. Отсасывайте раствор VTN из 100-миллиметровой чашки.
      5. Переложите hPSCs в чашку диаметром 100 мм, осторожно встряхните (вверх-вниз и влево-вправо, не по кругу), чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены в чашке
      6. Инкубировать при 37 °C, при 5%CO2.
      7. На следующий день отсадите всю среду и накормите 10 мл Е8.
      8. Кормите таким образом каждый день в течение следующих 3–4 дней, а затем приготовьтесь к разделению.
    2. Расщепление hPSCs
      ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs в точке расщепления должен быть на 80%–90% слитым. Следует наблюдать большие колонии с гладкими и яркими краями. Тем не менее, следует избегать контакта между каждой колонией (Рисунок 1B, день 0 и Рисунок 4B).
      1. При необходимости приготовьте посуду 100 мм с покрытием VTN.
      2. Отсадите Е8 и вымойте посуду, которую нужно разделить 1x с 1x PBS.
      3. Аспирируйте 1x PBS и добавьте 4 мл 0,25 М ЭДТА. Инкубировать в течение 2 мин при 37 °C, 5% CO2,
        заметка: ПСК должны быть разделены/повторно покрыты небольшими колониями. Не обрабатывайте этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) дольше 2 минут, чтобы предотвратить разделение на отдельные клетки. Клетки должны оставаться прикрепленными к поверхности посуды после 2-минутной обработки.
      4. Аспирируйте ЭДТА, отделите колонии, сильно пипетируя 10 мл среды Е8 на поверхность чашки, и соберите всю среду и клетки в пробирку объемом 15 мл.
      5. При слиянии hPSCs на 80%–90% колонии разделяются в соотношении 1:15–1:20. Например, чтобы разделить hPSCs в соотношении 1:20 на одну чашку 100 мм, возьмите 500 μL раствора E8/hPSCs и смешайте с 9,5 мл свежей среды E8.
      6. Пластинчатые ПСК в посуде 100 мм с покрытием VTN.<бр/> заметка: Рекомендуется устанавливать идеальное соотношение расщепления для каждого исследователя и клеточной линии независимо друг от друга.
    3. Замораживание hPSCs
      1. Для одной 100 мм чашки с hPSCs, готовой к расщеплению, приготовьте три криовалиала и 3,5 мл замораживающей среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Среду и флаконы следует хранить при температуре 4 °C или на льду до использования.
      2. Отсадите Е8 и вымойте посуду 2x с 1x PBS.
      3. Аспирируйте 1x PBS и добавьте 4 мл 0,25 М ЭДТА, инкубируйте 2 минуты при 37 °C, в 5% CO2,
        ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть заморожены в виде небольших колоний в момент их разделения. Не обрабатывайте клетки ЭДТА дольше 2 минут, чтобы предотвратить разделение на отдельные клетки. Клетки должны оставаться на поверхности посуды после 2-минутной обработки.
      4. Аспирируйте ЭДТА, отделите колонии, сильно пипетируя 10 мл 1x PBS на поверхность чашки, и соберите всю среду и клетки в пробирке объемом 50 мл.
      5. Добавьте 20 мл 1x PBS и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут, чтобы смыть остатки ЭДТА.
      6. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 3 мл замораживающей среды.
      7. Равномерно распределите hPSCs по трем криовиалам по 1 мл каждому.
      8. Хранить при температуре -80 °C в течение ночи в контролируемой морозильной камере или бутерброде из пенополистирола для обеспечения медленного перепада температуры, а затем переложить в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.

2. Посев hPSC для начала дифференцировки (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть готовы к дифференцировке после стабилизации (т.е. расщепления в 2–3 раза после размораживания). Убедитесь, что колонии здоровые, с гладкими, блестящими краями и минимальной дифференцировкой (рисунок 2B).

  1. При необходимости приготовьте посуду с матричным покрытием из базальной мембраны (24 лунки или 6 лунок) за день до дня 0. Принесите блюда в RT в начале дифференциации.
  2. При необходимости сделайте среду для дифференцировки за день 0–1.
  3. Отберите Е8 из слива, готового к расщеплению hPCS, и вымойте посуду 2x с 1x PBS.
  4. Добавьте 7 мл 0,25 М ЭДТА на 100 мм чашку, инкубируйте при 37 °C, 5%CO2, в течение 15 мин.<бр/> заметка: На этом этапе лечение ЭДТА удлиняется до рассредоточения на отдельные клетки.
  5. Отпишьте от всех ПСК (они должны быть плавающими) и переложите в пробирку объемом 50 мл. Добавьте такое же количество или больше 1x PBS в качестве раствора ЭДТА, чтобы разбавить ЭДТА.
  6. Центрифугируйте при 200 х г в течение 4 мин.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 1 мл среды для дифференцировки 0–1 дня и пипетируйте для гомогенизации клеток. Затем добавьте еще среды, а затем перемешайте, чтобы разбавить клеточный раствор до концентрации, идеальной для подсчета клеток.
    заметка: Не стоит чрезмерно разбавлять клеточный раствор. Для начала ячейки из одной полной чашки 100 мм следует развести в 5 мл среды.
  8. Подсчитайте количество клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
  9. Раствор клетки разбавляют по мере необходимости, чтобы достичь 125 000 клеток/см2 при низком конечном объеме (например, 2 мл на лунку для чашки на 6 лунок или 500 мкл на лунку для чашки на 24 лунки).
    заметка: Небольшой объем помогает клеткам прикрепляться быстрее.
  10. Отасуньте весь раствор матрицы базальной мембраны из посуды с покрытием и поместите раствор ячейки в лунки.
  11. Инкубировать при 37 °C, при 5%CO2.

3. Индукция клеток нервного гребня (день с 1 по 10, рисунок 1A)

  1. В 1-й день подкармливайте клетки средой для дифференцировки 0–1-го дня (3 мл на лунку для 6 лунок и 1 мл на лунку для 24 луночных посуды).
  2. На 2-й день кормят клетки средой для дифференцировки со 2 по 10 день (3 мл на лунку для 6 лунок и 1 мл на лунку для 24 луночных посуды).
  3. С этого момента клетки следует кормить через день до 10 дня (т.е. следующим днем кормления будет 4 день).
    заметка: Начиная с 6-го дня следует обнаруживать NC-гребни (Рисунок 1B). Чтобы проверить, происходит ли дифференцировка, рекомендуется проводить параллельную дифференцировочную культуру в небольших лунках (т.е. в 24 лунках), которые могут быть окрашены на SOX10/AP2a и использоваться для экспрессии маркерных генов во время дифференцировки (рис. 1B, C).
  4. Если вы сортируете ячейки, перейдите к разделу 4. В противном случае перейдите к разделу 5.

4. Флуоресцентная сортировка активированных клеток (FACS) для маркера нервного гребня CD49D и агрегация NC-клеток в сфероидах

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сортировки FACS образцы должны храниться на льду и не подвергаться воздействию света после окрашивания до сортировки.

  1. Подготовьте буфер FACS, если ячейки отсортированы.
  2. Готовят на 10–14 день сфероидную среду.
  3. На 10-й день удалите среду и промойте 1x с 1x PBS.
  4. Добавьте раствор диссоциации (см. Таблицу материалов) из расчета 2 мл на лунку для чашки на 6 лунок или 1 мл на лунку для чашки на 24 лунки и инкубируйте при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение 20 минут.
  5. Отпишьте все ПСК и переложите в трубку объемом 50 мл.
  6. Заполните оставшуюся часть пробирки буфером FACS и центрифугируйте при давлении 200 x g в течение 4 мин.<бр/> заметка: Каждая пробирка объемом 50 мл может вместить до 20 мл или менее клеточного раствора. Объем буфера FACS должен быть достаточно высоким для нейтрализации диссоциативного раствора.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки с соответствующим количеством буфера FACS (~2 мл на лунку 6-луночного планшета) и посчитайте, чтобы определить номер клетки.
  8. Подготовьте следующие образцы.
    1. Образец 1 (неокрашенный контроль): 1 x 106 клеток в 400 мкл буфера FACS. Отфильтруйте ячейки через крышку ситечка 20 мкм и держите пробирку на льду.
    2. Образец 2 (только контроль DAPI): 1 x 106 клеток в 400 мкл буфера FACS, содержащего 0,5 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Отфильтруйте клетки через трубку FACS с крышкой от фильтра и держите трубку на льду.
    3. Образец 3 (меченый CD49D): Суспензируйте остальные клетки буфером FACS, содержащим антитело CD49D, конъюгированное с фикоэритрином/цианином7 (PE/Cy7) (5 мкл для 1 x 106 клеток на 100 мкл буфера FACS) в пробирке объемом 15 мл и инкубируйте на льду в течение 20 минут.
  9. Заполните пробирки буфером FACS и центрифугируйте при давлении 200 x g в течение 4 минут.
  10. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждые 5–10 x10 6 клеток в 1 мл буфера FACS, содержащего 0,5 мкг/мл DAPI в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Отфильтруйте ячейки через трубку FACS с помощью крышки фильтра и держите трубку на льду.
  12. Подготовьте пробирки для сбора FACS, содержащие 2 мл буфера FACS.
  13. Отсортируйте устройство FACS с помощью лазеров, которые могут обнаруживать DAPI и PE-Cy7, чтобы изолировать популяцию CD49D+.
  14. После сортировки подсчитайте отсортированные ячейки.
  15. Центрифугируют все отсортированные клетки и ресуспендируют на 10–14-е сутки сфероидную среду до конечной концентрации 0,5 х 106 клеток на 500 мкл среды.
  16. Планшет 0,5 x 106 ячеек на лунку в сверхнизкое прикрепление 24 луночных планшета.
  17. Инкубируйте клетки при 37 °C, в 5%CO2.

5. Агрегирование NC-клеток в сфероидах

  1. Если вы не используете FACS для выделения НК-клеток, а вместо этого агрегируете их непосредственно в сфероиды, сначала подготовьте клетки, как описано в шагах 4.2–4.5.
  2. Заполните оставшуюся часть пробирки 1x PBS и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки соответствующим количеством сфероидной среды на 10–14-й день (например, ~2 мл среды на лунку для 6-луночного планшета) и посчитайте, чтобы определить количество клеток.
  4. Разбавляют клетки в сфероидной среде на 10–14-й день до 0,5 х 106 клеток на 500 мкл среды.
  5. Планшет 500 мкл клеточной суспензии на лунку в сверхнизком присоединении 24 луночных планшета.
  6. Инкубируйте клетки при 37 °C, в 5%CO2.

6. Поддержание сфероида НЗ и индукция симпатического предшественника (день с 10 по 14, рисунок 3A)

  1. Вариант 1: Минимальное культивирование сфероидов
    1. На 11-й день добавьте 500 мкл сфероидной среды 10–14-го дня к сфероидам НК без аспирации существующей среды с 10-го дня. Инкубировать при 37 °C, при 5%CO2.
    2. На 12-й день наклоните пластину, чтобы накопить сфероиды NC с одной стороны лунок. Осторожно отсасывайте и отбрасывайте как можно больше среды, а также скармливайте 1 мл 10–14 дня сфероидной среды.
    3. Продолжайте кормить клетки каждый день до 14 дня.
    4. Дополнительно: Если сфероиды агрегируются и образуют большой комок, используйте пипетку, чтобы разбить сфероидные комки. Это также гарантирует, что отдельные сфероиды не станут слишком большими.
      заметка: Идеальный диапазон размеров сфероидов должен составлять около 100–500 мкм. В пределах этого диапазона размер отдельных сфероидов не имеет критического значения. Тем не менее, морфология, такая как гладкие и четкие края (Рисунок 2 и Рисунок 4), важна для дальнейшего успеха. На 14-й день каждый 24-луночный планшет в идеале содержит около 50–60 сфероидов разных размеров в указанном диапазоне размеров.
  2. Вариант 2: Расширенная культура сфероидов
    1. На 15-е сутки для содержания сфероидов НК скармливают 1,5 мл сфероидной среды 10–14-го дня, содержащей 0,5 мкМ РА. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2,
      заметка: РА следует добавлять в свежем виде при каждом кормлении и всегда хранить при температуре -80 °C.
    2. С этого момента подкармливайте через день до 28 дня и далее продолжайте обработку сфероидов (раздел 7.1).
      заметка: Растущие сфероиды расщепляют примерно 1 раз в неделю путем пипетирования с помощью пипетки объемом 1 мл для их разделения. Они расщепляются в примерном соотношении 1:2–1:4. В течение 2-недельного периода расширения количество клеток должно увеличиться примерно в четыре раза.

7. Дифференцировка и созревание симпатических нейронов (SymN) (Вариант 1: после 14 дня; Вариант 2: после 28 дня)

  1. Гальванизация сфероидов в обычную посуду
    1. Подготовьте 24-луночные планшеты с покрытием PO/LM/FM.
    2. Приготовьте среду symN, содержащую 0,125 мкМ РА (добавляйте свежую каждую подкормку) и 10 мкМ Y27632 (только на 14-й день).
    3. На 14-й день наклоните пластину, чтобы накопить НК сфероиды с одной стороны лунок. Тщательно аспирируйте и выбросьте как можно больше среды, а также накормите 1 мл среды symN.
    4. Снимите LM/FN с пластин с покрытием.
    5. Разделите и профилируйте каждую лунку из 24-луночной пластины в 4 отдельные лунки новой, покрытой 24-луночной пластиной. Каждая исходная лунка будет иметь 1 мл, содержащий ~50–60 сфероидов. Это дает 250 μл, содержащих примерно 10–15 сфероидов для каждой лунки на новой пластине.
    6. Добавьте 250 мкл дополнительной среды на лунку.<бр/> заметка: Это разделение 1:4; Убедитесь, что сфероиды правильно распределены внутри раствора, чтобы расщепление было относительно равномерным. Количество сфероидов не учитывается, так как итоговое число не влияет на успешность генерации символов.
    7. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2.
    8. На 15-й день (или на 29-й день для варианта 2) кормят, заменив всю среду на 1 мл среды symN, содержащей 0,125 мкМ РА. С этого момента нейроны следует кормить каждые 2 дня до 20 дня (или 35 дня для варианта 2).
    9. После 20-го дня (или 35-го дня для варианта 2) нейроны следует подкармливать, осторожно заменяя только половину имеющейся среды (500 мкл). С этого момента подкармливайте каждую неделю, если среда быстро не пожелтеет.
    10. Продолжайте кормление еженедельно до желаемого момента времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: символы имеют тенденцию агрегироваться в ганглиевидные структуры и склонны отделяться от питательных чашек. Чтобы предотвратить это, рекомендуется полукормление и минимальное обращение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Индукция ЧПУ. (A) График и методы лечения для индукции НЦ с 0-го по 10-й день. (B) Морфология и формирование NC-гребней контролировались каждые 2 дня с помощью светлопольной микроскопии. Клетки в каждый момент времени после 2-го дня были окрашены в AP2A (красный) и SOX10 (зеленый). Все иммунофлуоресцентные снимки были компенсированы DAPI. Красными стрелкам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки для клеточных культур 100 ммсокол353003
Пробирки для культивирования конической ткани объемом 15 млVWR/Corning89039-664
24-луночные планшеты для культивирования тканейсокол353047
24-луночные планшеты со сверхнизким уровнем крепленияКорнинг07 200 601 и 07 200 602
Инкубатор для тканевых культур 5% CO2/20% O2Thermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
Пробирки для культивирования конической ткани 50 млVWR/Corning89039-656
6-луночные планшеты для культивирования тканейКостарNo 3516
АккутазаИнновационные клеточные технологииAT104500Решение для диссоциации клеток
Антитела против AP2aАбкамАБ108311Хозяин: Кролик; разведение 1:400
Антитела к Ascl1BD Pharmingen556604Хозяин: мышь IgG1; разведение 1:200
Антитела к CD49DБиолегенда304313Хозяин: мышь IgG1; 5 мкл/миллион клеток в объеме 100 мкл
Антитела к CD49D (изотип)Биолегенда400125Хозяин: мышь IgG1; 5 мкл/миллион клеток в объеме 100 мкл
Антитела к DAPIсигмаД9542Разведение 1:1000
Антитела к DBHИммуностарNo 22806Хозяин: Кролик; разведение 1:500
Антитела против GFPАбкамАБ13970Хозяин: Курица; разведение 1:1000
Антитела к HOXC9Санта Крус БиотехнологииСК-365692Хозяин: мышь IgG1; разведение 1:100
Антитела к NET1МабНЕТ17-1Хост: Мышь; разведение 1:1000
Антитела против PRPHСанта Крус БиотехнологииСК-377093/Н0112Хозяин: мышь IgG2a; разведение 1:200
Антитела к SOX10АбкамАБ50839Хост: Мышь; разведение 1:100
Антитела к THПел-ФризП40101- 150Хозяин: Кролик; разведение 1:500
аскорбиновая кислотасигмаА8960-5GКонцентрация материала: 100 мМ
Доплата B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010Концентрация запаса: 50x
БДНФСистемы НИОКР248-BDСтоковая концентрация: 10 мкг/мл
БМП4Системы НИОКР314-ВРКонцентрация материала: 6 мМ
Счетчик ячеекThermo Fisher/Life TechnologiesГрафиня II
Предметные стекла камеры подсчета ячеекИнвитрогенС10312
центрифугаЭппендорф57021 и 5424Р
CHIR99021Системы НИОКР4423Концентрация материала: 6 мМ
КриофлаконThermo Fisher/Life Technologies375353
Технология dbcAMPсигмаД0627Концентрация материала: 100 мМ
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Концентрация запасов: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057 (Английский)Концентрация запасов: 1x
ДмсоThermo Fisher/Life TechnologiesБП231-100
E6 среднийГИБКОА15165-01
E8 среднийГИБКОА15169-01Концентрация запасов: 1x
Дополнение к E8ГИБКОА15171-01Концентрация запаса: 50x
ЭдтасигмаЭД2ССКонцентрация материала: 0,5 м
Машина FACSБекман КоултерCytoFLEX (для FACS)
Машина FACSБекман КоултерMoFlo Astrios EQ (для сортировки)
Трубки FACS (синий колпачок фильтра)сокол352235
Трубки FACS (белый колпачок)сокол352063
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Атланта БиолаксС11150
ГДНФПепроТех450Стоковая концентрация: 10 мкг/мл
ГельтрексИнвитрогенA1413202Матрица базальной мембраны; Концентрация исходного материала: 100x
ГПСКThomson et al., (1998)ВА09
ГПСКО и др. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Фибронектин человека (FN)VWR/Corning47743-654Исходная концентрация: 1 мг/мл
L-глютаминТермо Фишер/GibcoNo 25030-081Концентрация материала: 200 мМ
Бак LNПользовательские биогенные системыВ-1500АБ
Мышиный ламинин I (LM)Системы НИОКР3400-010-01 (АнглийскийИсходная концентрация: 1 мг/мл
Доплата N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048Концентрация исходного материала: 100x
Нейробазальная средаГИБКОNo 21103-049Концентрация запасов: 1x
NGFПепроТех450-01Исходная концентрация: 25 мкг/мл
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco14190-136Концентрация запасов: 1x
Поли-L-орнитина гидробромид (ПО)сигмаП3655Исходная концентрация: 15 мг/мл
Примоцин (антибиотики)ИнвивоГенАНТПМ1Исходная концентрация: 50 мг/мл
Машина для количественной ПЦРЛаборатории Bio-RadC1000 Touch
Планшеты для количественной ПЦРЛаборатории Bio-RadHSP9601
рекомбинантный FGF2Системы НИОКР233-FB/CFСтоковая концентрация: 10 мкг/мл
Ретиноевая кислотасигмаР2625Концентрация материала: 1 мМ
SB431542Tocris/R&D системы1614Концентрация в запасе: 10 мМ
Трипан синийКорнингМТ-25-900-КИ
Витронектин (ВТН)Thermo Fisher/Life TechnologiesА14700Исходная концентрация: 0,5 мг/мл
Водяная баняVWR/Corning706308
У27632Системы НИОКР1254Концентрация в запасе: 10 мМ
) гг. г. г.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи