$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка
- Приготовьте 10 мл диссекционной среды и добавьте 200 мкл 100-кратного пенициллин-стрептомицина в 9,8 мл модифицированной игл-среды F12 от Dulbecco (DMEM/F12).
- Приготовьте раствор L-цистеина: на 10 мл воды для посева тканей добавьте 120 мг L-цистеина. Хранить раствор L-цистеина при температуре 4 °C до 2 недель или в аликвотах при -20 °C до 1 года.
- Приготовьте раствор DNase I: в 1 мл воды для посева тканей добавьте 10 мг DNase I. Храните раствор DNase I при температуре 4 °C до 2 месяцев.
- Приготовьте раствор папаина: для приготовления раствора папаина добавьте 100 мкл папаина (примерно 140 ЕД), 100 мкл ДНКазы I (1%) и 200 мкл L-цистеина (12 мг/мл) в 5 мл DMEM/F12. Каждый раз свежеприготовьте раствор папаина и стерилизуйте с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм перед использованием.
- Приготовьте моющий раствор: для приготовления 100 мл моющего раствора добавьте 650 мкл глюкозы 45%, 500 мкл 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты, HEPES 1 М и 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 93,85 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) 1x. Перед применением простерилизуйте моющий раствор с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм. Перед использованием простерилизуйте моющий раствор с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм. Храните моющий раствор при температуре 4 °C до 2 месяцев.
- Приготовьте раствор инсулина: для приготовления 2 мл раствора инсулина добавьте 25 мкл капли 10 Н гидроксида натрия (NaOH) и 100 мг инсулина в 2 мл воды для посева тканей.
- Приготовьте растворы эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста фибробластов (FGF): растворите оба митогена в DMEM/F12 в концентрации 100 мкг/мл. Хранить в виде 10 мкл аликвот при -20 °C.
- Приготовьте среды B-27 и N-2: добавки B-27 и N-2 храните при -20 °C в виде аликвот 500 мкл и 1 мл соответственно.
- Приготовьте среду для дифференцировки Z: для приготовления 100 мл среды для условий Z-дифференцировки добавьте 40 мл инсулина (50 мг/мл), 500 мл B-27, 1 мл N-2, 650 мл глюкозы 45% и 1 мл 100 x пенициллин-стрептомицина в 97,81 мл DMEM/F12. Перед использованием стерилизуйте среду для условий Z-дифференцировки с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм. Хранить среду для дифференцировки Z при температуре 4 °C до 1 недели.
- Приготовьте среду Z-состояния: для приготовления 50 мл среды Z-дифференцировки добавьте 10 мкл EGF и 10 мкл FGF в 50 мл стерильной среды для Z-дифференцировки (20 нг/мл). Храните среду с Z-кондицией при температуре 4 °C до 1 недели.
- Приготовьте покрывающий раствор для дифференцировочной культуры: для 5 мл раствора внеклеточного покрытия добавьте 100 мкл раствора внеклеточного матрикса (например, Matrigel) в 4,9 мл DMEM/F12. Разморозьте раствор внеклеточного матрикса при 4 °C на льду. После размораживания хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
2. Вскрытие мозга взрослой рыбки данио
- Подготовьте ложе для вскрытия, заполнив чашку Петри размером 100 мм x 15 мм пакетами со льдом. Затем накройте чашку Петри крышкой и выдерживайте при температуре -20 °C до тех пор, пока гель не замерзнет. Сверху на крышку положите квадрат чистой фильтровальной бумаги и оберните как фильтровальную бумагу, так и чашку Петри полиэтиленовой пленкой.
- Очистите и простерилизуйте все инструменты для микродиссекции с помощью 70% этанола или нагревайте перед каждым использованием. Поместите все стерилизованные инструменты для вскрытия рядом с микроскопом для препарирования и непосредственно перед эвтаназией поместите ложе для вскрытия под микроскоп с оптоволоконной подсветкой.
- Соберите 2 взрослых рыбок данио для подготовки нейросферы всего мозга и от 3 до 4 рыбок данио для создания нейросфер из рассеченных областей мозга.
- Усыпьте взрослых рыбок данио (в возрасте 8-12 месяцев) в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию. Далее погрузите рыбу в 75% этанол на 5-10 сек и быстро уложите в ложе для вскрытия с последующим обезглавливанием на уровне жабр с помощью хирургического лезвия.
- Чтобы усыпить животных, введите передозировку (300 мг/л) сульфоната метана трикаина до тех пор, пока сердцебиение животного постепенно не замедлится и кровообращение не остановится, затем погрузите в ледяную воду.
- Поверните голову спинной стороной вниз, и с помощью ножниц сделайте продольный разрез от срезанной стороны ко рту. С помощью щипцов обнажают основание черепа и удаляют все прилегающие ткани. Разрежьте боковые стенки черепа от начала спинного мозга по направлению к тектуму.
- С помощью ножниц разрежьте и удалите зрительные нервы, а затем удалите обе стороны самой боковой части черепа на уровне тектума. Поверните головку брюшной стороной вверх. С помощью щипцов отклеивают остальную часть самой апикальной части черепа.
- Перенесите мозг вместе с оставшейся частью черепа в новую чашку со средой для вскрытия (1.1). Очистите мозговую ткань в среде для препарирования с помощью пластиковой ручки микроножа, сохраняя все структуры мозга нетронутыми.
- С этого момента продолжайте протокол, используя весь мозг рыбок данио.
- В качестве альтернативы можно адаптировать этот протокол к конкретным областям мозга для создания нейросфер из всего мозга рыбки данио или из конечного мозга, тектума/промежуточного мозга или мозжечка, рассеченных свежим скальпелем. Используйте нейронную специфическую флуоресцентную нейротрансгенную линию данио-рерио, чтобы препарировать интересующую область мозга в соответствии с рисунком 1.
3. Диссоциация одиночных клеток мозга взрослого человека
- Все последующие работы выполняйте в шкафу биологической безопасности. Перенесите мозговую ткань в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 800 мкл диссекционной среды (приготовленной на шаге 1.1). Удалите диссекционную среду с помощью пипетирования, не задевая ткани мозга.
- Добавьте 500 μл раствора папаина (шаг 1.4) и переваривайте ткани мозга при 37 °C в течение 10 минут. Не инкубируйте дольше 15 минут, так как это может снизить жизнеспособность клеток.
- После инкубации перенесите мозговую ткань с 500 μл раствора папаина в коническую трубку объемом 15 мл с помощью наконечника пипетки объемом 1000 μл, разрезанного на ~0,25 дюйма от дна. Аккуратно диссоциируйте мозговую ткань, медленно пипетируя вверх и вниз 10 раз одним и тем же наконечником. Не пипируйте вверх и вниз более 15 раз и не образуйте пузырьки воздуха во время этого этапа, так как это может изменить жизнеспособность клеток.
- Снова инкубируйте ткань мозга при 37 °C в течение 10 минут, а затем пипетируйте вверх и вниз 10-13 раз с помощью неразрезанного обычного наконечника объемом 1000 мкл. Не проводите пипетирование вверх и вниз более 15 раз, чтобы избежать гибели клеток.
- Остановите ферментативное разложение, добавив 2 мл моющего раствора (шаг 1,5) и центрифугируйте клеточную суспензию при 800 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (ОТ). Осторожно сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в оставшемся растворе, энергично постукивая пальцем по трубке, а затем пипетируя вверх и вниз обычным наконечником объемом 1000 мкл. Далее добавьте 2 мл моющего раствора.
- На этом этапе проверяют под микроскопом, получена ли одноклеточная суспензия. Снова центрифугируйте клеточную суспензию при 800 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, используя 1 мл свежей Z-кондиционной среды (шаг 1.10).
- Окрашивайте клетки с помощью трипанового синего и подсчитывайте живые клетки с помощью гемоцитометра, исключая синие мертвые клетки. Приготовьте 24-луночный планшет с 200 мкл клеточной суспензии и 300 мкл свежей Z-кондиционной среды в каждой лунке. Затравочные клетки с плотностью ~500 клеток/мкл. Поддерживайте культивируемые клетки в инкубаторе при температуре 30 °C и 5%CO2, так как нейросферы мозга рыбок данио плохо растут при 37 °C.
4. Генерация первичных нейросфер
- Через 1 день in vitro (DiV1) понаблюдайте за суспензией одиночных клеток, полученной из всего мозга взрослого человека, под микроскопом и отметьте, не скопился ли мусор в центре лунки. Осторожно удалите мусор, пипетируя примерно 100 мкл среды (по возможности меньше). Далее добавьте 100 μл свежей среды Z-кондиции. В это время следует наблюдать за суспензиями одиночных клеток (рисунок 2A DiV1).
- Через 2 дня in vitro (DiV2) размножите культивируемые клетки. С помощью пипетки объемом 1 000 мкл с разрезанным наконечником соберите и перенесите 250 мкл клеточной суспензии из каждой лунки в новую лунку. Во все лунки добавьте 250 μл свежей среды Z-кондиции. Перед расширением культивируемых клеток очень осторожно гомогенизируйте суспензию путем пипетирования вверх и вниз по всей лунке.
- Повторяйте шаги 4.1 и 4.2 в течение следующих 4 дней in vitro (DiV4). Прогрессирующее увеличение размеров нейросфер должно быть видно в центре и по краям лунки в точках DiV3 и DiV4 (рис. 2B и C).
заметка: Первичные нейросферы могут быть обработаны для прохождения или дифференцировки для оценки мультипотентности. В качестве альтернативы они могут быть обработаны для нуклеофекции или липотрансфекции, чтобы охарактеризовать роль конкретных генов в процессе дифференцировки.
5. Прохождение первичных нейросфер
- Удалите по 250 мкл культуры тканей из каждой лунки и механически диссоциируйте нейросферы DiV4 с помощью пипетки объемом 1 мл. Не проводите пипирование вверх и вниз слишком быстро, так как образование пузырьков воздуха может увеличить гибель клеток.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и распределите 800 клеток/мкл в 250 мкл первичного супернатанта культуры в каждую лунку 24-луночного планшета.
- Добавьте в каждую лунку по 250 мкл среды Z-состояния.
- После 2 дней in vitro (DiV2) размножите культивируемые клетки, как описано на шагах 4.2 и 4.3.
6. Дифференцировка первичных нейросфер
- Стерилизуйте крышечные стаканы, погрузив их в 70% этанол на 10 минут, затем высушите защитные стаканы в режиме RT, поместив их в каждую лунку 12-луночной пластины.
- Добавьте 300 мкл раствора внеклеточного покрытия (шаг 1.11) в центр покровного стекла таким образом, чтобы оно могло широко расширяться и покрывать все покровное стекло. Затем инкубировать при 37 °C в течение 1 ч (с использованием увлажненного инкубатора для клеточных культур).
- После инкубации удалите раствор внеклеточного покрытия и высушите защитное стекло в течение 2 часов при 37 °C.
- Удалите по 250 мкл культуры тканей из каждой лунки. Механически диссоциируйте все первичные нейросферы DiV4 в лунке с помощью пипетки объемом 1 мл (с более широким концом) путем пипетирования вверх и вниз.
- Семена диссоциированных суспензий нейросферных клеток при плотности клеток 4 x 103 клеток/мл на предварительно приготовленных защитных стеклах, покрытых внеклеточным матриксом (шаг 6.1-6.3) и выдерживают не менее 30 мин при 30 °С при 5%CO2 до прикрепления к субстрату. Затем удалите питательную среду и быстро добавьте 1 мл предварительно подогретой свежей среды для дифференцировки Z-дифференцировки (шаг 1.9) перед культивированием клеток в течение 24 часов при 30 °C с 5%CO2.
- Каждые два дня заменяйте половину среды для условий Z-дифференцировки в период дифференцировки клеток.
