Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Генерация органоидов мозга (23 дня)
- Начало нейроэктодермы (5 дней)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом дифференцировки следует учесть следующие моменты. Метод перепрограммирования (на основе лентивируса, сендай-вируса, эпизода или микроРНК и т.д.) для получения ИПСК человека в идеале должен быть одинаковым для всех пациентских и контрольных линий ИПСК. Доступны различные комплекты для перепрограммирования и инструкции на основе опубликованных протоколов. Качество линий iPSC человека является ключом к достижению оптимальной дифференциации. Контролируйте морфологию колоний и клеток с помощью микроскопа и подтверждайте плюрипотентность, проверяя экспрессию маркеров, таких как Oct3/4, Nanog или TRA-1-60.
- Культивирование человеческих ИПСК в условиях отсутствия корма в среде А на чашке, покрытой матрицей Энгельбрета-Холма-Роя (EHS).
заметка: Выращивайте человеческие ИПСК без питательных веществ и сыворотки, чтобы поддерживать определенное состояние культуры и избежать дополнительного этапа удаления эмбриональных фидерных клеток мыши (MEF) до начала дифференцировки. Оптимальное число пассажей для начала дифференцировки человеческих ИПСК колеблется от пассажа 15 при перепрограммировании до пассажа 70 в целом. При прохождении отделяйте колонии hiPSC по мере агрегации клеток, используя соответствующий раствор для удаления клеток с низким механическим напряжением и серологическую пипетку объемом 2 мл для переноса агрегатов в новую чашку. Избегайте диссоциации до отдельных клеток, так как это может вызвать дифференцировку и апоптоз в большинстве линий иПСК. Сообщалось, что долгосрочное пассирование одиночных клеток может увеличить геномные изменения в человеческих ИПСК человека. Избегайте процедур отслойки клеток, которые требуют этапа центрифугирования для удаления раствора отслойки, так как это снижает общую жизнеспособность иПСК. Регулярно проверяйте все культуры на микробную контаминацию, особенно на микоплазму, поскольку это может изменить качество иПСК и их способность к дифференцировке.
- Покройте чашку для культуры тканей диаметром 60 мм матрицей EHS в соответствии с инструкциями производителя.
- Разморозьте аликвоту 1 x 106 человеческих iPSCs. Засейте иПСК в 60-миллиметровую чашку для культуры тканей, покрытую матрицей EHS и содержащую 5 мл среды А (см. таблицу материалов). Меняйте среду ежедневно и проходите через 5-7 дней, когда клетки достигнут ~80% конфлюенции.
заметка: Оттопленные ИПСК пропускают при 80% конфлюенции с использованием стандартных методов, таких как бесферментное отделение колоний, по крайней мере, один раз до начала дифференцировки. Короче говоря, удалите среду iPSC, промойте клетки предварительно подогретой до 37 °C модифицированной средой Dulbecco's Modified Eagle's Medium: питательной смесью F-12 (DMEM/F12) и инкубируйте iPSCs в соответствии с инструкциями производителя с использованием реагента A (см. таблицу материалов). Не превышайте рекомендуемое время инкубации во избежание диссоциации до отдельных клеток. ИПСК человека должны быть отделены и плавать как агрегаты, а не как отдельные клетки. Затем они могут быть перенесены в новую посуду с матричным покрытием EHS; Например, агрегаты iPSC из одной 60-мм тарелки могут быть распределены по 4 новым 60-мм тарелкам.
b. Проверьте наличие микоплазмы с помощью набора для обнаружения микоплазмы в соответствии с инструкциями производителя. Используйте только ИПСК без микоплазмы, так как микоплазма может изменять способность к дифференцировке ИПСК
- Диссоциировать иПСК (80% конфлюента) и получить одноклеточную суспензию с использованием реагента В
- Промойте iPSCs один раз предварительно подогретым (37 °C) DMEM/F12.
- Добавьте предварительно подогретый реагент B (например, 1 мл в чашке диаметром 60 мм) и инкубируйте iPSCs в течение 5 минут при 37 °C и 5%CO2.
- Проведите 20 раз кончиком пальца по бокам и дну тарелки, чтобы отсоединить иПСК. Проверьте на отслоение клеток под микроскопом.
- Пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз в чашке 5 раз микропипеткой объемом 1 мл.
- Добавьте 3 мл среды А, чтобы развести 1 мл реагента В и соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Осторожно уменьшите iPSCs (500 x g) в течение 4 минут при комнатной температуре.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды В и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
заметка: Имейте в виду, что для ресуспензии следует использовать только среду B. Избегайте использования среды А, так как она содержит слишком высокую концентрацию bFGF, которая может препятствовать дифференцировке.
- Разбавляют клеточную суспензию до 4,5 х 105 клеток/мл в среде В с добавлением 10 мкМ ингибитора ро-ассоциированной протеинкиназы (Y-27632).
- Добавьте 100 μL на лунку в неадгезивный 96-луночный планшет с V-образным дном.
заметка: Убедитесь, что клетки равномерно распределены в суспензии, каждый раз встряхивая пробирку перед извлечением порций объемом 100 мкл. Важно, чтобы каждая лунка содержала эквивалентное количество клеток, чтобы получить однородные по размеру и форме нейросферы (круглые, четко выраженные поверхности).
- Осторожно опустите планшет с ячейками при 500 x g и комнатной температуре в течение 3 минут и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2.
- Ежедневно меняйте среду, удаляя 50 мкл и добавляя по 50 мкл свежей среды B в каждую лунку в течение следующих 5 дней.
2. Встраивание нейросфер в матрицу EHS (4 дня)
- Приготовьте среду нейросферы, смешав следующее: смесь 1:1 DMEM/F12 и среды C (v/v), 1:200 (v/v) добавка 1, 1:100 (v/v) добавка 2 без (без (без) витамина A, 1:100 L-глутамина, 0,05 мМ заменимых аминокислот (MEM), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1,6 г/л инсулина и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола.
- Соберите нейросферы с помощью микропипетки объемом 200 мкл с помощью наконечника ~2 мм, предварительно отрезанного стерильными ножницами.
- Поместите нейросферы на расстоянии примерно 5 мм друг от друга на парафиновую пленку (3 х 3 см2) в пустую посуду диаметром 100 мм и осторожно удалите как можно больше оставшейся среды.
- Добавьте каплю (7 мкл) матрицы EHS на каждую отдельную нейросферу.
- Инкубировать капли матрицы EHS с нейросферами в течение 15 мин в инкубаторе.
- Нейросферы тщательно промойте от парафиновой пленки, промыв их нейросферной средой. Для промывки используйте микропипетку объемом 1 мл и новую чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10 мл нейросферной среды.
- Инкубируйте нейросферы в течение следующих 4 дней и добавьте 2 мл свежей среды нейросферы на 2,< день />
заметка: Убедитесь, что полки в инкубаторе плоские, чтобы нейросферы, встроенные в матрицу EHS, не слипались на одной стороне чашки.
3. Органоиды в культуре ротационной суспензии (14 дней)
- Приготовьте органоидную среду мозга, смешав следующее: смесь 1:1 DMEM/F12 и среда C (v/v), 1:200 (v/v) добавка 1, 1:100 (v/v) добавка 2 без витамина A, 1:100 L-глутамина, 0,05 мМ MEM, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1,6 г/л инсулина, 0,5 мкМ дорсоморфина, 5 мкМ SB431542, и 0,05 мМ β-меркаптоэтанол.
- Добавьте 100 мл органоидной среды мозга в каждую колбу через боковые рычаги и поместите их в инкубатор для предварительного прогрева не менее чем на 20 минут.
- Настройте программу перемешивания на 25 об/мин в соответствии с инструкциями производителя.
заметка: Прежде чем переносить нейросферы, встроенные в матрицу EHS, в колбы, убедитесь, что все они разделены. Если два или более соединены через матрицу EHS, разделите их, разрезав соединительную матрицу скальпелем.
- Осторожно перенесите нейросферы, встроенные в матрицу EHS, в колбы, содержащие 100 мл органоидной среды, с помощью серологической пипетки объемом 2 мл. Используйте боковые рычаги колбы спиннера для переноса нейросфер в колбу.
- Поместите вращающиеся колбы на магнитную платформу для перемешивания в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2; это 0-й день органоидной культуры.
- Меняйте среду один раз в неделю (или чаще, когда происходит изменение цвета), удалив половину среды и добавив такое же количество свежей среды.
заметка: При извлечении колб из инкубатора подождите 3-5 минут, чтобы органоиды опустились на дно колбы. Удалите среду, поместив стеклянный наконечник пипетки (подключенный к насосу) на поверхность жидкости; Осторожно отсасывайте среду через одно боковое отверстие/рычаг колбы. Эти манипуляции необходимо проделывать под ламинарным капюшоном.