Индуцированная электростимуляцией дифференцировка нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников

Аннотация

Источник: Chang, H. et al., Дифференцировка нейронных клеток-предшественников в микрофлюидных устройствах, индуцированная электрическим полем.J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует использование микрофлюидного чипа, покрытого внеклеточным матриксом, для дифференцировки нейральных стволовых и прогениторных клеток или NPC с помощью электрической стимуляции. После посева и прилипания к покрытой области NPC растут, и применение постоянного тока запускает их дифференцировку в нейроны, астроциты и олигодендроциты.

Протокол

1. Проектирование и изготовление многоканальной, оптически прозрачной, электротактической (MOE) микросхемы

1. Нарисуйте шаблоны для отдельных слоев полиметилметакрилата (ПММА) и двустороннего скотча с помощью соответствующего программного обеспечения (рис. 1A, Таблица материалов). Отрежьте листы ПММА и двустороннюю ленту с помощью лазерного станка CO₂ (Рисунок 1B).
   1. Включите лазерный регистратор CO₂ и подключите его к персональному компьютеру. Откройте файл разработанного шаблона с помощью программного обеспечения.
   2. Поместите листы ПММА (275 мм x 400 мм) или двусторонний скотч (210 мм x 297 мм) на платформу лазерного расшифровщика (рис. 2A). Направьте лазер на поверхность листов из ПММА или двустороннего скотча с помощью инструмента автофокусировки.
   3. Выберите лазерный распылитель в качестве принтера, а затем «распечатайте» шаблон с помощью лазерного расшифровщика, чтобы начать прямую абляцию на листе ПММА или двустороннем скотче и получить отдельные узоры на листе или ленте из ПММА (рис. 2B).
2. Снимите защитную пленку с листов ПММА и очистите поверхность с помощью газообразного азота.
   заметка: В соответствии с предыдущим отчетом была выполнена черчение рисунка из ПММА и непосредственная механическая обработка листа из ПММА.
3. Для склеивания нескольких слоев листов ПММА сложите три куска листов ПММА толщиной 1 мм (слои 1, 2 и 3) и склейте их под давлением 5 кг/^см2 в термическом склеивателе на 30 мин при 110 °C, чтобы сформировать узел канала проточного/электростимуляционного канала (рис. 2C).
   заметка: Разные партии коммерчески полученных листов ПММА имеют несколько разную температуру стеклования (Tg). Оптимальная температура склеивания должна быть испытана с шагом 5 °C вблизи Tg.
4. Приклейте 12 адаптеров к отдельным отверстиям в слое 1 узла стружки MOE с помощью быстродействующего цианоакрилатного клея.
   заметка: Адаптеры изготовлены из ПММА методом литья под давлением. Плоские поверхности в нижней части предназначены для подключения к микросхеме MOE. Адаптеры с внутренней резьбой 1/4W-28 предназначены для подключения белых заглушек, разъемов с плоским дном или адаптеров Люэра. Будьте осторожны при использовании быстродействующего цианоакрилатного клея. Избегайте попадания брызг в глаза.
5. Продезинфицируйте подложки из ПММА толщиной 1 мм (слои 1-3), двусторонний скотч (слой 4) и оптический материал из ПММА диаметром 3 мм (слой 5) с помощью ультрафиолетового (УФ) облучения в течение 30 минут перед сборкой чипа (Рисунок 1A).
6. Приклейте подложки из ПММА толщиной 1 мм (слои 1-3) к оптическому ПММА диаметром 3 мм (слой 5) с помощью двустороннего скотча (слой 4), чтобы завершить сборку из ПММА (слои 1-5) (рисунок 1A).
7. Подготовьте чистое покровное стекло для сборки на чипе.
   1. Залейте десятикратное разведение моющего средства в баночку для окрашивания (см. Таблицу материалов), и очистите покровное стекло в этом моющем средстве с помощью ультразвукового очистителя в течение 15 минут.
   2. Тщательно промойте баночку для окрашивания под проточной водой из-под крана, чтобы удалить все следы моющего средства.
   3. Продолжайте полоскать дистиллированной водой, чтобы удалить все следы водопроводной воды, и повторите шаг 1.7.2 два раза.
   4. Высушите очищенное защитное стекло, обдув его газообразным азотом.
8. Перед сборкой микросхемы продезинфицируйте узел из ПММА (слои 1-5), двустороннюю ленту (слой 6) и защитное стекло (слой 7) с помощью ультрафиолетового излучения внутри шкафа биобезопасности в течение 30 минут (рисунок 1A).
9. Приклейте очищенное защитное стекло (слой 7) к сборке из ПММА (слои 1-5) с помощью двустороннего скотча (слой 6) (рисунок 1A).
10. Инкубируйте чип MOE в вакуумной камере на ночь; используйте сборку чипа MOE для последующих процедур (рис. 3).

2. Покрытие поли-L-лизином (ФАПЧ) на субстрате в областях клеточной культуры

1. Подготовьте трубку из политетрафторэтилена, соединитель с плоским дном, конусный соединитель, адаптер Люэра с конусом, белую заглушку для пальцев (также называемую пробкой), адаптер Люэра, шприц с замком Люэра и черную резиновую насадку (Рисунок 4A, Таблица материалов). Стерилизуйте все вышеперечисленные компоненты в автоклаве при температуре 121 °C в течение 30 минут.
2. Загерметизируйте отверстия адаптеров агарового моста (Рисунок 1A) белыми заглушками, плотно прилегающими к пальцам. Подсоедините разъем с плоским дном к микросхеме MOE в сборе с помощью переходников на входе и выходе среды (рис. 4B). Подсоедините адаптер конуса Люэра к 3-позиционным запорным кранам.
3. Добавьте 2 мл 0,01% раствора ФАПЧ с помощью шприца объемом 3 мл, который подключается к 3-ходовому запорному крану среднего входа (Рисунок 4B-).
4. Подключите пустой шприц объемом 3 мл к 3-ходовому запорному крану среднего розетки (Рисунок 4B-).
5. Заполните участки клеточных культур раствором ФАПЧ. Вручную медленно прокачивайте раствор для покрытия вперед и назад. Закройте два 3-ходовых запорных крана, чтобы раствор запечатался внутри областей культивирования.
6. Инкубируйте чип MOE при температуре 37 °C в течение ночи в инкубаторе, заполненном 5% атмосферы_CO2.

3. Подготовка сети соляных мостов

1. Следуя шагу 2.6, откройте два 3-ходовых запорных крана и смойте пузырьки в каналах, вручную перекачивая раствор покрытия туда и обратно в канале с помощью двух шприцев.
2. Наберите 3 мл полной среды (среда для поддержания стволовых клеток, состоящая из модифицированной Игл-среды Дульбекко/питательной смеси Хама F-12 (DMEM/F12), 2% добавки B-27, 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл bFGF) в шприц объемом 3 мл, который подключается к 3-ходовому запорному крану входного отверстия среды (Рисунок 4B- и рисунок 4B- ).
3. Добавьте 3 мл готовой среды для замены покрывающего раствора в областях клеточных культур. Подсоедините пустой шприц объемом 5 мл к 3-ходовому запорному крану средней розетки (рисунок 4B-).
4. Подготовьте сеть соляных мостов (рисунок 5).
   1. Разрежьте черный резиновый стержень, чтобы получить зазор, и вставьте электроды серебра (Ag)/хлорида серебра (AgCl) через черный резиновый стержень в шприц с замком Люэра (Рисунок 4A).
   2. Замените белую заглушку на адаптер Люэра и введите 3% горячей агарозы, чтобы заполнить адаптер Люэра.
      заметка: Для приготовления горячей агарозы растворите 3 г порошка агарозы в 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и стерилизуйте в автоклаве при 121 °C в течение 30 минут.
   3. Подсоедините шприц с замком Люэра к адаптеру Люэра. Введите 3% горячую агарозу через черный резиновый бинг, чтобы наполнить шприц с замком Люэра с помощью шприца с иглой. Подождите от 10 до 20 минут, чтобы агароза остыла и застыла.
      заметка: Для того чтобы увеличить объемную емкость агарозы, шприц с замком Люэра устанавливается на адаптер Люэра (Рисунок 4 и Рисунок 5). Затем большие электроды вставляются в шприц с замком Люэра. Электрод способен обеспечить стабильную электрическую стимуляцию в течение длительного эксперимента.

4. Подготовка mNPC

1. Культивируйте mNPC в полной среде в колбе для культивирования клеток 25T при температуре 37 °C в инкубаторе, заполненном 5% атмосферой_CO2. Субкультивируйте клетки каждые 3-4 дня и проводите все эксперименты с клетками, прошедшими 3-8 пассажей от исходного источника.
2. Перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл и раскрутите нейросферы со скоростью 100 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и промойте нейросферы 1x PBS Дульбекко (DPBS). Раскрутите нейросферы при 100 × g в течение 5 минут.
3. Аспирируйте 1x DPBS, а затем повторно суспендируйте нейросферы в полной среде. Тщательно и аккуратно перемешайте.
4. Добавьте 1 мл суспензии нейросферы с помощью шприца объемом 1 мл, который подключается к 3-ходовому запорному крану выпускного отверстия (Рисунок 4B-).

5. Настройка микрофлюидной системы для импульсной стимуляции постоянным током (Рисунок 6)

1. Установите микросхему MOE с затравкой на прозрачный нагреватель из оксида индия и олова (ITO), который закреплен на программируемом моторизованном столике X-Y-Z.
   заметка: Температура поверхности ITO контролируется пропорционально-интегрально-производным регулятора и поддерживается на уровне 37 °C. Термопара K-типа зажимается между чипом и нагревателем ITO для контроля температуры областей клеточных культур внутри чипа. Микросхема MOE устанавливается на программируемый моторизованный столик X-Y-Z и подходит для автоматического получения цейтраферного изображения на отдельных участках канала. Изготовление нагревателя ITO и настройка системы нагрева клеточных культур были описаны ранее.
2. Вводите mNPC путем ручной закачки в микросхему MOE через выходное отверстие для среды. Инкубируйте микросхему MOE, засеянную клеточными ячейками, на нагревателе ITO при температуре 37 °C в течение 4 часов.
3. Через 4 ч прокачать всю среду через микросхему MOE через входное отверстие для среды со скоростью потока 20 мкл/ч с помощью шприцевого насоса.
   заметка: mNPC выращиваются и поддерживаются в чипе в течение дополнительных 24 часов перед стимуляцией электрическими полями (EF), чтобы обеспечить прикрепление и рост клеток. Отработанная жидкость собирается в пустой шприц объемом 5 мл, подключенный к 3-ходовому запорному крану выпускного отверстия, показанному как «отходы» на рисунке 6A. Конфигурация микрофлюидной системы MOE показана на рисунке 6. Эта микрофлюидная система обеспечивает непрерывное снабжение клеток питательными веществами. Вся свежая среда непрерывно закачивается в чип MOE для поддержания постоянного значения pH. Таким образом, клетки можно культивировать вне инкубатора с_CO2.
4. Используйте электрические провода для подключения мультиплексора EF к микросхеме MOE с помощью электродов Ag/AgCl на микросхеме. Подключите мультиплексор EF и генератор функций к усилителю для вывода прямоугольных импульсов постоянного тока с амплитудой 300 мВ/мм с частотой 100 Гц при 50% рабочих циклов (50% времени включения и 50% времени выключения) (рис. 6B).
   1. Подключите электрические провода к мультиплексору EF. Подключите электрические провода к микросхеме MOE с помощью электродов Ag/AgCl.
   2. Подключите мультиплексор EF к усилителю с помощью электрических проводов. Подключите генератор функций к усилителю и цифровому осциллографу.
      заметка: Мультиплексор EF представляет собой схему, которая включает в себя импеданс камеры культуры в цепи и соединяет все отдельные камеры в параллельную электронную сеть. Каждая из трех камер для культивирования электрически соединена последовательно с переменным резистором (Vr) и амперметром (показан как μA на рисунке 6A) в мультиплексоре. Электрический ток в каждой камере для культивирования изменяется путем регулирования Vr, и ток отображается на соответствующем амперметре. Напряженность электрического поля в каждой области клеточной культуры рассчитывалась по закону Ома, I= σEA, где I — электрический ток, σ (установлено как 1,38 С·^м-1 для DMEM/F12) — электропроводность питательной среды, E — электрическое поле, а A — площадь поперечного сечения электротаксической камеры. Для размера области клеточной культуры, показанной на рисунке 1, электрический ток составляет ~87 мА и ~44 мА для постоянного тока и постоянного импульса при 50% коэффициенте заполнения соответственно.
5. Подвергайте mNPC воздействию прямоугольных импульсов постоянного тока с амплитудой 300 мВ/мм с частотой 100 Гц в течение 48 часов. Непрерывно прокачивайте всю среду со скоростью 10 μл/ч для обеспечения достаточного питания клеток и поддержания постоянного значения pH в среде.

Результаты

Рисунок 1: Подробная конфигурация многоканального оптически прозрачного электротактического чипа.(A) Разнесенный вид сборки микросхемы MOE. Микросхема MOE состоит из листов ПММА (50 мм x 25 мм x 1 мм), двустороннего скотча (50 мм x 25 мм x 0,07 мм), адаптеров (10 мм x 10 мм x 6 мм), листа ПММА оптического класса (50 мм x 75 мм x 3 мм), двустороннего скотча (24 мм x 60 мм x 0,07 мм), ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Подложки из ПММА толщиной 1 мм (слои 1-3)	Бат	К2Р20	Полиметилметакрилат (ПММА), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
Пластиковая туба объемом 15 мл	Протек Технолоджи Энтерпрайз Ко., Лтд	СТ-15-ПЛ-ТВ	Трубка с коническим дном и крышкой, в сборе, предварительно стерилизованная
Шприц объемом 3 мл	ТЕРУМО	Видеорегистратор-3413	Шприцы для приема внутрь объемом 3 мл без иглы
Оптический сплав ПММА 3 мм (слой 5)	Корпорация ЧИ Мэй	Лист из ПММА ACRYPOLY	Оптический сорт ПММА
3-х ходовой запорный кран	НИПРО	НЦН-3Л	Стерильный одноразовый 3-х ходовой запорный кран
Шприц объемом 5 мл	ТЕРУМО	Видеорегистратор-3410	Пероральные шприцы объемом 5 мл, без иглы
адаптер	Донг Чжун Ко., Лтд.	Настроить	Адаптер из ПММА
агароза	Сигма-Олдрич	А9414	Агароза, низкая температура желирования
усилитель	А.А. Лаб Системс Лтд	А-304	Высоковольтный усилитель
Программное обеспечение AutoCAD	Компания «Автодеск»	Образовательная версия	черчение
Добавка к B-27	Gibco	12587-010	Добавка B-27 (50x), минус витамин A
Основной фактор роста фибробластов (bFGF)	Пепротех	АФ-100-18Б	Также называется рекомбинантным человеческим FGF-basic
Черная резиновая банда	ТЕРУМО	Видеорегистратор-3413	Из пероральных шприцев объемом 3 мл, без иглы
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	В4287	Блокирующий реагент
центрифуга	СЯНТАЙ	ЦВ2060	центрифуга
Регистратор CO2-лазера	Корпорация «Лазер Тулс энд Техникс»	ILS-II	Приобретено у http://www.lttcorp.com/index.htm
Конусный разъем	IDEX Здоровье и наука	Ф-120Х	Цельный уплотнительный 10-32 конусный, для наружного диаметра 1/16" натуральный
Адаптер Конуса-Люэра	IDEX Здоровье и наука	-659	Адаптер Luer 10-32 с гнездом на гнездо Luer, PEEK
Конфокальный флуоресцентный микроскоп	Leica Microsystems	ТКС SP5	Инструкция по эксплуатации Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Цифровой фотоаппарат	Олимп	Е-330	Автоматическое получение цейтраферных изображений
Цифровой осциллограф	Компания Tektronix	TDS2024	Измеряйте сигналы напряжения или тока с течением времени в электронной схеме или компоненте для отображения амплитуды и частоты.
Двусторонний скотч	3 МИН.	ПЭТ 8018	Приобретено у http://en.thd.com.tw/
Модифицированная смесь Eagle's medium/Ham's nutrient mix F-12 (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, порошок, HEPES
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, порошок, без кальция, без магния
Мультиплексор EF	Азиатский Скай Ко., Лтд.	Настроить	Контроль и управление электрическим током в отдельных каналах
Эпидермальный фактор роста (EGF)	Пепротех	АФ-100-15	Также называется рекомбинантным человеческим EGF
Быстродействующий цианоакрилатный клей	3 МИН.	7004Т	Прочный клей мгновенного действия (жидкий)
Разъем с плоским дном	IDEX Здоровье и наука	-206	Бесфланцевая наружная гайка Delrin, 1/4-28 плоскодонная, для наружного диаметра 1/16" синего цвета
Генератор функций	Agilent Technologies	33120А	Высокопроизводительный синтезированный генератор функций с частотой 15 МГц и встроенной функцией сигнала произвольной формы
Стекло из оксида индия-олова (ITO)	Мерк	300739	Для обогревателя ITO
Термопара типа K	Текпель	ТПК-02А	Термопары с температурой
Адаптер Люэра	IDEX Здоровье и наука	П618-01	Адаптер Luer с внутренней резьбой Luer на 1/4-28 с наружной резьбой полипропилен
Шприц с замком Люэра	ТЕРУМО	Видеорегистратор-3413	Для мостиков из агаровых солей
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Базовая жизнь	БЛ2651	Моющий раствор
Поли-L-лизин (PLL)	сигма	П4707	Решение для нанесения покрытий
Прецизионная крышка стекол толщиной No 1,5H	МАРИЕНФЕЛЬД	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Программируемая моторизованная сцена X-Y-Z	Танлиан Инк	Настроить	Приобретено у http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Пропорциональный, интегрально-производный (ПИД) регулятор	Тохо Электроникс	ТТМ-Дж4-Р-АБ	Регулятор температуры
Трубка из ПТФЭ	Professional Plastics Inc. Тайваньский филиал	Внешний диаметр 1/16 дюйма	Белая полупрозрачная трубка из ПТФЭ
Шприцевой насос	Нью Эра Системз Инк	НЭ-1000	NE-1000 Программируемый одношприцевой насос
Моющее средство TFD4	ФРАНКЛАБ	ТФД4	Средство для мытья защитных стекол
Термический бондер	Компания Kuan-MIN Tech Co.	Настроить	Приобретено в http://kmtco.com.tw/
Ультразвуковой очиститель	Лев	ЛЕО-300С	Ультразвуковой стери-очиститель
вакуумная камера	ДЭН ЮНГ ИНСТРУМЕНТС КО., ЛТД.	ДОВ-30	Вакуумная сушильная печь
Белая заглушка с плотным зажимом	IDEX Здоровье и наука	-316	1/4-28 Плоскодонный, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html