$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
Рисунок 1 иллюстрирует схематический обзор рабочего процесса этого протокола.
1. Перепрограммирование и обслуживание iPSC
- Соберите 8 мл крови субъекта (пожилого или больного пациента; в возрасте 65 лет и старше) в пробирки для подготовки клеток (CPT) с цитратом натрия или в этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) или гепаринизированные пробирки.
- Центрифугируйте при 1800 x g в течение 30 минут при комнатной температуре (RT) для сбора гранул, содержащих только периферическую кровь и не содержащих сыворотки.
- Используйте специализированные векторы перепрограммирования в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов) для получения iPSCs.
- Культивирование iPSCs в 6-луночных культуральных планшетах, покрытых матрицей базальной мембраны, не содержащей питательных веществ, не содержащих лактозиздегидрогеназы и повышающего уровень вируса (LDEV), в 6-луночных культуральных планшетах в среде Essential 8 (E8) (см. Таблицу материалов) при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2.
- Поддерживайте ИПСК в среде Е8 в течение 3-4 дней, чтобы избежать переполненности или спонтанной дифференцировки.
- Подтвердите плюрипотентность линий iPSC с помощью иммунофлуоресцентных маркеров (шаг 2) и проведите тест на микоплазму (шаг 3).
2. Окрашивание плюрипотентностью
- Для сохранения растворов и антител затравливают клетки на покрытые оболочкой (шаг 1.4) 24-луночные культуральные планшеты за 3-4 дня до анализа. Отсадите среду с помощью пипетки и зафиксируйте клетки 4% формальдегидом в фосфатно-солевом буфере (1x PBS) на 15-20 минут при РТ.
- Промойте клетки 3x 1x PBS и пермеабилизируйте 0,1% Triton-X 100 в 1% бычьем сывороточном альбумине (BSA) в PBS в течение не менее 15 мин, но не более 1 ч в RT.
- Промойте 3x с 1x PBS и заблокируйте 5% BSA в PBS на 30 минут при RT.
- Промойте еще раз 3 раза 1x PBS и добавьте антитела Sox2 и Oct3/4 (разведение 1:100; см. Таблицу материалов), а также нуклеиновый краситель DAPI в 1% BSA (разведение 1:4000) в течение ночи при 4 °C. Оберните алюминиевой фольгой для защиты от света.
- Промойте 3x с 1x PBS и оставьте ячейки в PBS. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа при 10-20-кратном увеличении. Убедитесь, что маркеры плюрипотентности, определяющие пол, область Y-box 2 (Sox2) и октамерсвязывающий транскрипционный фактор 3/4 (Oct3/4) локализованы в ядрах клеток.
3. Тестирование микоплазмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к протоколу набора для обнаружения (см. Таблицу материалов) для получения подробных шагов выполнения анализа и анализа. Набор для детектирования содержит реагент, субстрат и буфер для анализа для тестирования микоплазмы.
- Перед пробитием клеток или освежающей среды соберите 2-3 мл среды для клеточных культур в центрифужную пробирку и гранулируйте любые клетки или мусор в концентрации 200 x g в течение 5 минут в режиме RT. Храните надосадочную жидкость при 4 °C в течение ≤5 дней. Инкубируйте клетки со средой в течение не менее 24 часов, чтобы обеспечить обнаруживаемый сигнал.
- Добавьте 100 мкл надосадочной жидкости в свежую пробирку или лунку 96-луночного планшета с белыми стенками (рекомендуется непрозрачное дно, см. Таблицу материалов). Восстановите реагент и субстрат в буфере для анализа и уравновесьте в течение 15 минут при RT.
- Добавьте в образец 100 мкл реагента и инкубируйте в течение 5 мин при ЛТ. Измерьте люминесценцию с помощью люминометра (измерение #1).
- Добавьте в образец 100 μL субстрата и инкубируйте в течение 10 минут при RT. Измерьте люминесценцию (измерение #2).
- Определяют контаминацию микоплазмой по соотношению измерения #2 к #1. Обратитесь к руководству к набору для интерпретации результатов.
4. Подготовка микрофиламентов
- Начните приготовление полифиламентов (молочная ко-гликолевая кислота) (PLGA, см. Таблицу материалов) с измельчения шовной нити тупым концом скальпеля. Слегка сбрызните изношенное волокно 70% этанолом.
- Под микроскопом и с помощью линейки начните разрезать волокно PLGA на фрагменты длиной от 500 мкм до 1 мм. Всего отрежьте около 25 мм волокна. Держите нити в пробирке объемом 15 мл с 1 мл антибиотико-антимикотического раствора.
- В вытяжке разведите раствор клетчатки с 10 мл DMEM/F-12 (Таблица 1). Вортекс хорошо перемешать раствор.
заметка: Работа в проточном колпаке для клеточных культур в стерильной среде.
- Добавьте 20 мкл раствора волокна в три эмбриоидных тела (БЭ), образуя лунки 96-луночного планшета. Под помощью светлопольной микроскопии подсчитывают и усредняют волокна на лунку. Разбавьте или сконцентрируйте в среднем до 5-10 микрофиламентов PLGA на лунку. Подготовьте каждый хорошо таким образом.
- Теперь скважины готовы к заселению ячейками. Храните тарелку при комнатной температуре до необходимости или при температуре 4 °C в течение следующих суток.
5. Образование эмбриоидного тела (EB)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды и решения должны быть подогреты до RT.
- Как только ИПСК достигнут 70%-80% конфлюенции (Рисунок 2A), они готовы к прохождению и использованию для формирования БЭ. Проверьте клетки с помощью микроскопа при 10-20-кратном увеличении. Убедитесь, что колонии демонстрируют минимальные (<10%) участки спонтанной дифференцировки.
- Отсадите среду с помощью пипетки и промойте клетки одним приемом фосфатно-солевого буфера (DPBS) Дульбекко. Диссоциируйте колонии, добавив 500 мкл раствора для отделения клеток (см. Таблицу материалов) или 0,5 мМ ЭДТА и инкубируйте в течение 3-5 мин при 37 °C.
заметка: Работа в проточном колпаке для клеточных культур в стерильной среде.
- Соберите высвободившиеся клетки, добавив 1 мл свежей среды E8 в каждую лунку, и осторожно пипетируйте, пока все клетки не отделятся.
- Перелейте 1,5 мл клеточной суспензии в пробирку объемом 15 мл и добавьте еще 1 мл свежей среды Е8, чтобы получить общий объем 2,5 мл.
- Центрифугируйте при 290 x g в течение 3 мин при RT.
- Отасканируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки, ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды Essential 6 (E6, см. Таблицу материалов) с добавлением 50 мкМ ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 60 000-90 000 клеток/мл, в зависимости от желаемой плотности посева, в среде Е6 с добавлением 50 мкМ ингибитора ROCK (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 150 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета со сверхнизким прикреплением (ULA) (или подготовленного вогнутого планшета). Засейте 9 000-11 000 клеток в лунку.
- Центрифугируйте планшет для принудительного агрегирования клеток при 290 x g в течение 1 минуты при RT. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C во увлажненную атмосферу с 5%CO2.
6. Нейроэпителиальная индукция
- Через 24 ч осторожно отаскайте 120 мкл среды с помощью пипетки. Следите за тем, чтобы не отсасывать ЭБ, опуская наконечник пипетки слишком глубоко в лунку.
- Добавьте 150 мкл среды Е6 (при ОТ) с добавлением 2 мкМ XAV939 и ингибиторов супрессора матерей против декапентаплегических (SMAD): 10 мкМ SB431542 и 500 нМ LDN 193189 на лунку (см. таблицу материалов).
- Ежедневно меняйте среду на свежеприготовленную среду E6 с добавлением 2 мкМ XAV939, 10 мкМ SB431542 и 500 нМ LDN 193189,<бр/>
заметка: К 6-му дню (DIV6) EB должны иметь диаметр 550-600 мкм и быть готовыми к дальнейшей дифференциации.
7. Дифференцировка и созревание органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все носители должны быть подогреты до RT.
- Примерно на DIV7 проверьте, все ли БЭ достигли диаметра 550-600 мкм и имеют ли они гладкий и четкий край (рис. 2B); на этом этапе они готовы к встраиванию во внеклеточный матрикс (ВКМ).
заметка: Работа в стерильных условиях.
- Подготовьте закладные листы с ямочками из термопластичной герметизирующей пленки (см. Таблицу материалов), поместив лист пленки (длиной около 4 дюймов) на пустую коробку P200. Используя коническую пробирку объемом 15 мл или микроцентрифужную пробирку объемом 500 мкл, аккуратно вдавите лист пленки в отверстия, чтобы сделать 12 углублений. Распылите на пленочный лист 70% этанола и дайте ему высохнуть внутри проточного колпака с включенным ультрафиолетовым излучением не менее 30 минут.
- Разморозьте достаточное количество матрицы базальной мембраны (Матригель, см. Таблицу материалов) на льду и поместите ее внутрь проточного колпака.
заметка: Для расчета ЭБ требуется примерно 30 мкл неразбавленной мембранной матрицы. Всегда держите мембранную матрицу ниже 4 °C, чтобы предотвратить ее загустение. Также рекомендуется использовать предварительно охлажденные наконечники для пипеток, так как они замедляют полимеризацию матрицы в наконечнике во время пипетирования, тем самым уменьшая потери материала.
- С помощью наконечника P200 с широким отверстием перенесите по одному EB на каждую ямочку и удалите как можно больше среды с помощью обычного наконечника для дозатора. Следите за тем, чтобы не дать EB высохнуть. Используя обычный наконечник P200, добавьте ~30 μL неразбавленной мембранной матрицы к каждому органоиду, следя за тем, чтобы EB находился в центре капли.
- После того, как все БЭ будут внедрены в матрицу, поместите лист пленки, содержащий БЭ, в стерильную чашку Петри.
заметка: По желанию, небольшая чашка Петри, наполненная стерильной водой, может быть помещена в большую чашку Петри рядом с пленочным листом, чтобы предотвратить испарение.
- Перенесите чашку в инкубатор и инкубируйте при температуре 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2 в течение примерно 10 минут, чтобы мембранная матрица затвердела.
- Для каждого набора из 12 встроенных органоидов приготовьте 5 мл дифференцировочной среды с В27 без витамина А (Таблица 1) в одной лунке 6-луночного планшета ULA. Предварительно прогрейте тарелку до 37 °C в инкубаторе.
- По истечении времени инкубации перенесите внедренные БЭ на 6-луночный планшет ULA, взяв лист пленки и выдавив углубления с обратной стороны листа. При необходимости возьмите 1 мл из лунки и нанесите его пипеткой на лист, чтобы капли отделились от пленки.
заметка: Важные морфологические изменения можно заметить через 1 день после встраивания; БЭ переходят от гладких краев к выпуклым выступам, образующим бутоны (Рисунок 2C).
- Через 2 дня (DIV9) выполните смену половины носителя. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать и не повредить капли мембранной матрицы в процессе.
- Еще через 2 дня (DIV11) проведите полную смену среды, добавив в среду 3 мкМ CHIR99021 (см. Таблицу материалов).
- В DIV14 измените среду на среду для дифференцировки с B27 с витамином А (Таблица 1) для постепенного увеличения размера органоидов.
- На DIV16 поместите пластину лунки на орбитальный шейкер со скоростью вращения 90 об/мин внутри инкубатора. Меняйте носители каждые 2 дня.
- Каждые 40 ДИВ разбавляйте 500 мкл мембранной матрицы на каждые 50 мл среды для получения дополнительных питательных веществ в среде.
Таблица 1: Состав среды для дифференцировки, использованной в настоящем исследовании.
| реагент | Окончательная концентрация | Объем (всего 50 мл) |
| ДМЭМ-Ф12 | 50% | 25 мл |
| Нейробазальная среда | 50% | 25 мл |
| Добавка N2 (100x) | 1x | 0,25 мл |
| Добавка B27 -/+ Витамин А (50x) | В 0,5 раза | 0,5 мл |
| инсулин | 0,25% | 12,5 мкл |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 мл |
| MEM-NEAA (100-кратный) | В 0,5 раза | 0,25 мл |
| ГЕПЕС (1 М) | 10 мМ | 0,5 мл |
| Антибиотик/антимикотик (100x) | 1x | 0,5 мл |
| 2-β-меркаптоэтанол | 50 мкМ | 17,5 мкл |
| ПРИМЕЧАНИЕ: некоторые DMEM-F12 уже содержат GlutaMAX, нет необходимости добавлять дополнительные. |
