Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
Все реагенты и оборудование, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов и должны использоваться стерильно. Если не указано иное, среду следует нагреть до комнатной температуры (RT) перед использованием. Обзор протокола совместной культуры см. на рисунке 1.
1. Дифференцировка предшественников моторных нейронов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs)
- Следуйте протоколу дифференцировки моторных нейронов, адаптированному из предыдущего исследования, до достижения состояния нейронных предшественников (NPC) на 10-й день. Согласно временным рамкам протокола, дифференциация начинается в понедельник (день 0), что приводит к тому, что NPC 10-го дня появляются в четверг.
- Криоконсервация дня 10 NPC в нокаут-замене сыворотки на 10% диметилсульфоксид (ДМСО) в плотности 2 x 106-4 x 106 клеток во флаконе.
осторожность: ДМСО токсичен: ручка в вытяжном шкафу со средствами индивидуальной защиты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что примерно 50% дня 10 NPC будут жизненно важны после размораживания. Остановите протокол дифференцировки моторных нейронов в этом состоянии «10-й день NPC» и криоконсервируйте NPC для создания большого количества NPC, которые могут быть сохранены и использованы позже, сократив общую продолжительность протокола совместного культивирования с 28 до 19 дней.
2. Получение и поддержание мезоангиобластов человека (MABs)
ПРИМЕЧАНИЕ: МАБ - это сосудистые мезенхимальные стволовые клетки, которые в данном случае были получены из биопсии, полученной от 58-летнего здорового донора. Доступны альтернативные коммерческие источники. Кратко поясняется протокол получения МАБ. Для получения дополнительной информации обратитесь к подробному протоколу. Перед использованием все среды MAB должны быть нагреты до 37 °C.
- Измельчите биопсийную ткань и инкубируйте на коллагеновой (из телячьей кожи) посуде толщиной 6 см в питательной среде (табл. 1) в течение 2 недель. Меняйте среду каждые 4 дня.
- Для приготовления коллагенового покрытия растворите 100 мг коллагена в 20 мл 0,1 М уксусной кислоты. Коллагену требуется время, чтобы раствориться, поэтому поместите смесь на качающуюся платформу на ночь в режиме RT. На следующий день долейте 80 мл ddH2O до конечного объема 100 мл.
осторожность: Уксусная кислота токсична; ручка в вытяжном шкафу со средствами индивидуальной защиты.
заметка: Коллаген из покрытия из телячьей кожи можно использовать повторно до 5 раз. Хранить при температуре 4 °C.
- Смажьте всю поверхность посуды или колбы коллагеном, закройте и инкубируйте в течение 20 минут при RT внутри ламинарного потока. Через 20 минут восстановите коллаген в свежем контейнере, закройте пустую тарелку/колбу и оставьте на 10 минут в RT в ламинарном потоке.
- Перенесите чашку/колбу в инкубатор для ночной (или не менее 6 часов) инкубации (37 °C, 5%CO2). Промойте 5 раз фосфатно-солевым раствором Дульбекко без кальция или магния (DPBS) перед нанесением покрытий на клетки.
- Через 14 дней FACS (сортировка флуоресцентных активированных клеток) сортирует MAB на наличие щелочной фосфатазы человека с последующей дальнейшей экспансией. Поддерживайте МАБ на покрытых коллагеном колбах Т75 в питательной среде и меняйте питательную среду каждые 2 дня (10 мл на колбу).
- Криоконсервация, пассаж или посев MAB в устройствах при достижении 70% конфлюенции.
заметка: МАБ теряют свой миогенный потенциал из-за спонтанных слияний при межклеточном контакте. Убедитесь, что слияние не превышает 70% при расширении MAB. Одна колба с 70% сливающейся колбой Т75 содержит примерно 600 000-800 000 клеток, которые могут быть крионированы, по 100 000 клеток на флакон. Каждый флакон позже можно разморозить и засеять в колбу T75 для расширения.
- Чтобы пропустить MAB, осторожно промойте их один раз 7 мл DPBS, а затем инкубируйте в 7 мл раствора для диссоциации MAB в течение 3 минут при 37 °C в 5%CO2 для диссоциации клеток.
- Нейтрализуйте раствор для диссоциации MAB с помощью 7 мл питательной среды, аккуратно соскребите клетки и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Аккуратно промойте колбу еще 5 мл питательной среды, чтобы собрать потенциально оставшиеся МАБ.
- Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 3 мин при 300 x g, затем пропустите непосредственно в новую колбу T75, покрытую коллагеном, для расширения, криоконсервации в нокаутирующей сыворотке с 10% ДМСО или подсчета до посева в микрофлюидном устройстве><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пассажи выполняются 1-2 раза в неделю для расширения клеток до максимального числа пассажей 13. При диссоциации МАБ кажутся сферическими и крупными по форме при рассмотрении под микроскопом.
3. Подготовка предварительно собранных микрофлюидных устройств - День 9
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол адаптирован из протокола нейронных устройств производителя микрофлюидных устройств и был адаптирован для использования как предварительно собранных, так и силиконовых устройств. Здесь предварительно собранные устройства используются для иммуноцитохимии (ИКХ) и регистрации переходных процессов кальция в живых клетках, в то время как силиконовые устройства используются для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Временная шкала протокола соответствует временной шкале протокола дифференцировки моторных нейронов.
- Подготовьте микрофлюидные устройства за день до засева клеток, так как покрытие должно инкубироваться в течение ночи. Согласно протоколу двигательных нейронов, это будет среда. Добавьте ~10 мл 70%-100% этанола в чашку Петри диаметром 10 см. С помощью щипцов перенесите устройство из транспортировочного контейнера в чашку Петри для стерилизации.
- Погрузите устройство в этанол на 10 с и перенесите устройство с помощью щипцов на лист бумаги, чтобы высушить на воздухе в ламинарном потоке в течение ~30 мин. Переверните устройство несколько раз, чтобы дать обеим сторонам высохнуть. Когда устройство высохнет, с помощью щипцов переместите каждое устройство в индивидуальную чашку Петри диаметром 10 см для удобства использования.
осторожность: Этанол токсичен; ручка в вытяжном шкафу со средствами индивидуальной защиты
- Покройте устройство поли-L-орнитином (PLO) (100 мкг/мл) в DPBS и инкубируйте при 37 °C, 5%CO2 в течение 3 ч.
- С помощью пипетки P200 добавьте 100 мкл PLO в DPBS в верхнюю лунку, расположенную как можно ближе к отверстию канала, и наблюдайте, как жидкость проходит из верхней лунки через канал в нижнюю лунку. Впоследствии в придонную скважину добавляют 100 мкл PLO в DPBS.
- Повторите то же самое с другой стороной микроканавок и в завершение добавьте 100 мкл с одной стороны устройства, чтобы создать градиент объема между двумя зеркальными сторонами устройства для покрытия микроканавок (например, правая сторона 200 μл, левая сторона 300 μл). Через 3 часа промойте прибор 3 раза в течение 5 минут с помощью DPBS. При необходимости используйте всасывающую систему.
заметка: Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха в каналах в любой момент во время нанесения покрытия или культивирования ячеек. Даже небольшие пузырьки расширяются в течение короткого времени, тем самым препятствуя покрытию, засеву клеток или потоку среды через канал. Если жидкость остановилась в канале во время нанесения покрытия, повторно суспендируйте раствор PLO непосредственно в канал с обеих сторон. Если пузырьки все еще присутствуют, используйте 200 мкл DPBS для промывки канала и повторите процесс нанесения покрытия, как указано выше в шагах 3.3.1-3.3.2. Если после затравки клеток появились пузырьки, восстановить устройство невозможно, так как промывка канала приведет к повреждению клеток.
- Покройте устройство ламинином (20 мкг/мл) в нейробазальной среде и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, 5%CO2. Следуйте тем же инструкциям по нанесению покрытия PLO из шагов 3.3.1-3.3.2.
- На следующий день с помощью пипетки P200 расположите наконечник в лунке, противоположной отверстию канала, чтобы удалить ламининовый слой из лунок. Добавьте DPBS во все лунки и оставьте устройства с DPBS в ламинарном потоке на RT для посева ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента важно не удалять жидкость (ламининовое покрытие, DPBS, медиа, фиксирующий раствор и т. д.) непосредственно из каналов, так как это может привести к образованию пузырьков воздуха. Всегда осматривайте приборы под микроскопом перед засевом клеток.
4. Гальванизация NPC в микрофлюидных устройствах - День 10
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно протоколу дифференцировки моторных нейронов, осаждение NPC 10-го дня происходит в четверг.
- Используйте свежедиссоциированных NPC 10-го дня или разморозьте 1-2 флакона накопленных NPC на 10 мл среды двигательных нейронов 10-го дня (Таблица 2 и Таблица 3) с раствором ингибитора ROCK (10 мкл/мл) и центрифугируйте клеточную суспензию при 100 x g в течение 4 мин.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500-1000 мкл среды двигательных нейронов на 10-й день с раствором ингибитора ROCK (10 мкл/мл) и подсчитайте живые клетки любым предпочтительным методом подсчета.
заметка: Как указано ниже, убедитесь, что NPC повторно суспендированы в нужное количество среды, чтобы обеспечить оптимальный объем посева.
- Удалите DPBS из двух лунок с одной стороны микроканавок в устройстве с помощью пипетки P200 и засейте 250 000 NPC на каждое устройство в 60-100 μл среды двигательных нейронов на 10-й день.
- В верхнюю правую лунку засейте 30-50 мкл клеточной суспензии (125 000 клеток) рядом с отверстием канала под углом 45° и осторожно перетащите оставшуюся жидкость по дну лунки к центру лунки с помощью наконечника пипетки.
- Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы суспензия клеток протекла через канал, прежде чем повторить это в нижней лунке (125 000 клеток в 30-50 мкл). С помощью ручки отметьте затравленную сторону «NPC» или эквивалент для удобной ориентации устройства без микроскопа.
- Инкубируйте устройство при 37 °C, 5%CO2 в течение 5 минут, чтобы обеспечить прикрепление клеток, прежде чем долить в двухсемянные лунки дополнительную среду для 10 двигательных нейронов (всего 200 мкл/лунка) и снова инкубируйте при 37 °C, 5% CO2,
заметка: Каждая лунка может содержать 200 μл. Затравка клеток как в лунках, так и в каналах обеспечивает прочную структуру культуры, снижая риск отслоения клеток при смене среды. Можно засеять меньше клеток только в канале. Тем не менее, это сделает культуру более восприимчивой к объемному току по каналам при каждой смене среды.
- С помощью пипетки P200 удалите DPBS из двух лунок на другой стороне микробороздок напротив только что посеянных NPC. Добавьте 200 μл/лунку среды двигательных нейронов на 10-й день и подождите несколько секунд между верхней и нижней лунками, чтобы среда прошла через канал. Затем добавьте 6 мл DPBS на 10 см посуды вокруг устройства, чтобы предотвратить испарение среды во время инкубации.
заметка: При необходимости добавьте дополнительные DPBS вокруг устройства в период культивирования.
- Выполните полное изменение среды двигательных нейронов в обоих отсеках устройства на 11-й день (пятница), 14-й день (понедельник) и 16-й день (среда) (Таблица 2 и Таблица 3). Добавляйте свежие добавки в день смены среды. <чел/>
заметка: С этого момента выполняйте все смены среды с помощью пипетки P200. Всегда располагайте наконечник пипетки в стороне от канала на краю лунки и не удаляйте жидкость непосредственно из канала. Будьте осторожны, чтобы не отсоединить силиконовые устройства. Удаление и добавление среды следует производить медленно, чтобы предотвратить отслоение клеток.
- Осторожно удалите все среды в обеих лунках с помощью NPC, расположив наконечник пипетки P200 на нижнем крае стенки лунки напротив отверстия канала. Медленно добавьте 50-100 мкл свежей среды для мотонейронов в верхнюю лунку, расположив наконечник пипетки P200 на верхнем краю стенки лунки напротив отверстия канала.
- Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы среда прошла через канал, прежде чем добавить 50-100 мкл среды двигательных нейронов в нижнюю лунку. Осторожно повторяйте этот процесс до тех пор, пока в обеих лунках не будет 200 μл/лунка. Повторите на стороне без ячеек.
5. Нанесение MAB в микрофлюидных устройствах - День 17
- Примерно за 7 дней до посева МАБ в микрофлюидные устройства (10-й день дифференцировки моторных нейронов) разморозьте МАБ и засейте их в питательную среду (табл. 1) в колбе Т75, покрытой коллагеном, чтобы обеспечить достаточный рост клеток. Смотрите раздел 2.
- На 17-й день дифференцировки моторных нейронов (четверг) диссоциируйте МАБ, как описано в шаге 2.4, ресуспендируйте клеточную гранулу в ~500 мкл питательной среды и подсчитайте живые клетки, используя любой предпочтительный метод подсчета.
заметка: Как указано ниже, убедитесь, что MAB снова суспендированы в нужное количество среды, чтобы обеспечить оптимальный объем посева.
- Удалите среду двигательных нейронов на незасеянной стороне микроканавок в устройстве с помощью пипетки P200, аккуратно промойте DPBS и засейте 200 000 MAB на устройство в 60-100 μл питательной среды.
- В верхнюю правую лунку засейте 30-50 мкл клеточной суспензии (100 000 клеток) рядом с отверстием канала под углом 45° и осторожно перетащите оставшуюся жидкость по дну лунки к центру лунки с помощью наконечника пипетки. Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы дать возможность прохождению клеток через канал, прежде чем повторить в нижней лунке (100 000 клеток в 30-50 мкл).
- Инкубируйте устройство при 37 °C, 5%CO2 в течение 5 минут, чтобы обеспечить прикрепление клеток, прежде чем доливать две только что засеянные MAB лунки дополнительной питательной средой (всего 200 μл/лунка). Снова инкубировать при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 17-й день на 17-й день не требуется никаких изменений в среде со стороны моторных нейронов устройства. Изменение среды на 17-й день в соответствии с ранее опубликованным методом дифференцировки моторных нейронов проводится на 18-й день (пятница).
6. Реализация объемного и хемотаксического градиента для стимулирования роста невритов двигательных нейронов в направлении компартмента MAB
- На 18-й день выполните полное изменение среды на стороне моторных нейронов с помощью среды для моторных нейронов на 18-й день (200 мкл/лунка). Следуйте инструкциям по изменению среды, упомянутым в шагах 4.5.1-4.5.2. Инициируйте дифференцировку MAB в отсеке MAB устройства (Таблица 2 и Таблица 4).
- Тщательно промойте отсеки MAB с помощью DPBS перед добавлением предварительно подогретой среды для дифференцировки MAB (Таблица 4) с добавлением 0,01 мкг/мл человеческого агрина (200 мкл/лунка). <бр/>
заметка: МАБ сливаются и образуют многоядерные миотрубки в течение одной недели.
- На 21-е сутки, согласно протоколу дифференцировки моторных нейронов (понедельник), инициируют хемотаксический и объемный градиент (табл. 2 и табл. 3).
- Добавьте 200 мкл/лунку базальной среды моторных нейронов с 30 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF), нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеток (GDNF) и цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), человеческого агрина (0,01 мкг/мл) и ламинина (20 мкг/мл) в компартмент миотрубки (ранее определенный как компартмент МАБ). Добавить базальную среду моторных нейронов (100 мкл/лунка) без факторов роста в компартмент моторных нейронов.
Таблица 1: Среда для роста МАБ.Среда может храниться 2 недели при 4 °C. bFGF добавляется в свежем виде в день использования.
| реагент | Концентрация запасов | Конечная концентрация |
| ИМДМ | 1x | 80% |
| Фетальная бычья сыворотка | | 15% |
| Пенициллин/стрептомицин | 5000 Ед/мл | 0,5% |
| L-глютамин | В 50 раз | 1% |
| Пируват натрия | 100 мМ | 1% |
| Заменимые аминокислоты | в 100 раз | 1% |
| Инсулин трансферрин селен | в 100 раз | 1% |
| bFGF (добавлен свежий) | 50 мкг/мл | 5 нг/мл |
Таблица 2: Базальная среда моторных нейронов.Среда может сохраняться 4 недели при 4 °C.
| реагент | Концентрация запасов | Конечная концентрация |
| DMEM/F12 | | 50% |
| Нейробазальная среда | | 50% |
| Пенициллин/стрептомицин | 5000 Ед/мл | 1% |
| L-глютамин | В 50 раз | 0,5 % |
| Дополнение N-2 | в 100 раз | 1% |
| В-27 без витамина А | В 50 раз | 2% |
| β-меркаптоэтанол | 50 мМ | 0,1% |
| аскорбиновая кислота | 200 мкМ | 0,5 мкМ |
Таблица 3: Добавки для среды моторных нейронов.Добавки добавляются в свежем виде в день употребления в базальную среду двигательных нейронов.
| день | реагент | Концентрация запасов | Конечная концентрация | отделение |
| День 10/11 | Разглаженный агонист | 10 мМ | 500 нм | оба |
| Ретиноевая кислота | 1 мМ | 0,1 мкМ | |
| ДАПТ | 100 мМ | 10 μМ |
| БДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл |
| ГДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл |
| День 14 | ДАПТ | 100 мМ | 20 μМ | оба |
| БДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл | |
| ГДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл |
| День 16 | ДАПТ | 100 мМ | 20 μМ | оба |
| БДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл | |
| ГДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл |
| CNTF | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл |
| День 18 | БДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл | Двигательный нейрон |
| ГДНФ | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл | |
| CNTF | 0,1 мг/мл | 10 нг/мл |
| День 21+ | БДНФ | 0,1 мг/мл | 30 нг/мл | Миотруб |
| ГДНФ | 0,1 мг/мл | 30 нг/мл | |
| CNTF | 0,1 мг/мл | 30 нг/мл |
| Агрин | 50 мкг/мл | 0,01 мкг/мл |
| Ламинин | 1 мг/мл | 20 мкг/мл |
| День 21+ | Без добавок | | | Двигательный нейрон |
Таблица 4: Среда дифференцировки МАБ.Среда может храниться 2 недели при 4 °C. Агрин добавляется в свежем виде в день использования.
| день | реагент | Концентрация запасов | Конечная концентрация | отделение |
| День 18 | DMEM/F12 | | 97% | MAB |
| Пируват натрия | 100 мМ | 1% |
| Сыворотка для лошадей | | 2% |
| Агрин | 50 мкг/мл | 0,01 мкг/мл |
