$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Рассечение эмбрионов и диссоциация тканей
- Взрослые самки крыс (200-250 г) содержатся при постоянной температуре (22 ± 1 °C) и относительной влажности (50%) при регулярном графике работы свет-темнота (освещение с 7 утра до 7 вечера) в помещении для животных. Убедитесь, что еда и вода находятся в свободном доступе.
- Обезболить беременную самку крысы после 18 дня развития (Е18) с использованием 3% изофлурана. Затем принесите животное в жертву при вывихе шейки матки.
- Удалите гиппокампы из каждого эмбриона крысы и поместите их в ледяной сбалансированный раствор соли Хэнка без Ca2+ и Mg2+. На 18 день развития ткани гиппокампа и коры головного мозга очень мягкие и их не нужно разрезать на мелкие кусочки. Более подробную информацию можно найти здесь.
- Диссоциировать ткань в 0,125% растворе Трипсина/Хэнка, содержащем 0,05% ДНКазы, в течение 18-20 мин при 37 °С.
- Удалите надосадочный раствор с помощью пастеровской пипетки и остановите ферментативное расщепление, добавив среду с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в течение 5 минут.
- Удалите среду с помощью FBS и промойте один раз средой с его добавкой, 1% L-глютамином, гентамицином 10 мкг/мл. Снова удалите среду с помощью пастеровской пипетки и снова наполните ее небольшим количеством (500 мкл) питательной среды с ее добавкой, 1% L-глутамина, гентамицина 10 мкг/мл.
- Диссоциируйте тканевую гранулу механическим способом с помощью узкой пастеровской пипетки до появления молочной суспензии клеток. Центрифугировать клеточную суспензию не нужно.
- Разбавьте небольшой объем клеточной суспензии питательной средой до получения конечного объема 2,0 мл. Подсчитайте полученную клеточную концентрацию с помощью камеры гемоцитометра. Разбавьте эту концентрацию в соотношении 1:5 для получения желаемой концентрации клеток 600-700 клеток/мкл.
2. Покрытие ячеек
- Пластинчатые клетки с плотностью около 2000 клеток/мм2 на активную область MEA, определенную ограничением PDMS, для создания двумерной нейронной сети.
заметка: Каждый гиппокамп содержит примерно 5 x 105 клеток (1 x 106 для одного эмбриона). Препарируйте 6 эмбрионов, чтобы получить общее количество 6 x 106 клеток в 2 мл и предполагаемую концентрацию 3000 клеток/мкл. Разбавьте эту концентрацию в соотношении 1:5 с целью получения желаемой концентрации клеток и наденьте около 600-700 клеток/мкл. Если площадь MEA, ограниченная ограничением PDMS, составляет около 7,065мм2, а общее количество пластинчатых ячеек 600 ячеек/мкл х 24 мкл = 14 400 ячеек, то итоговая плотность составит 2038 ячеек/мм2.
- Поместите устройства MEA в инкубатор с увлажненной атмосферойCO2 (5%) при температуре 37 °C.
- Распределите 160 мкл суспензии с концентрацией клеток 600-700 клеток/мкл (около 100 000 клеток) на поверхность монослоя микрогранул, расположенных внутри многолуночных планшетов, чтобы завершить предварительный этап построения трехмерной культуры. Поместите многолуночные планшеты в инкубатор с увлажненной атмосферой CO2 (5%) при температуре 37 °C.
3. 3D Построение нейронной сети
- Через 6-8 ч после нанесения покрытия очень осторожно перенесите суспензию (микрошарики с нейронами) из многолуночных планшетов внутрь зоны, ограниченной ограничением PDMS, с помощью набора пипеток объемом около 30-40 мкл. После каждого переноса подождите около полуминуты, чтобы микрошарики могли самостоятельно собраться в шестиугольную компактную структуру.
- После того, как все слои будут осаждены и спонтанно собраны, заполните большую каплю около 300 мкл среды верхнюю часть области, ограниченной ограничением PDMS.
- Поместите 3D-структуру, соединенную с MEA, в инкубатор (T = 37,0 °C, CO2 = 5%) на 48 часов перед добавлением окончательного объема (около 1 мл) культуры питательной среды с ее добавкой.
заметка: Рассмотрим общее количество валиков на многолуночных планшетах с мембранной вставкой (30 000) и количество бусин на одном слое на устройстве MEA (6 000). Полученная 3D-структура состоит из 5 слоев микрогранул и клеток. Учитывая, что трехмерная нейронная сеть не является геометрически совершенной, полученная 3D-структура может состоять из 5-8 слоев.
- На следующий день после нанесения покрытия осторожно добавьте окончательный объем среды (около 900 μл) внутрь кольца MEA. Выдерживайте 3D-культуры во влажной атмосфере с содержаниемCO2 (5%) при температуре 37 °C в течение 4-5 недель. Заменяйте половину среды раз в неделю.