Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение и культивирование кортикальных астроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги протокола по крайней мере за 7 дней, прежде чем переходить к следующим шагам, так как культуры астроцитов должны развиться в сливающиеся монослои, прежде чем нейроны будут подготовлены. Первичные астроциты получают из смешанных глиальных культур, полученных от детенышей мышей примерно на 0-3-й день после рождения. Следует использовать три мозга (6 корков) на колбу T75.
- Приготовьте астроцитарную среду, добавив модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM) 10% v/v лошадиной сыворотки и 0,1% v/v гентамицина в стерильных условиях. Хранить среду при температуре 4 °C до 2 недель.
- Покройте 3x T75 колбами с 10 мкг/мл поли-D-лизина (PDL; в воде, пригодной для клеточных культур) в течение не менее 1 ч при 37 °C в присутствии 6% v/v CO2. После нанесения покрытия дважды промойте колбы фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления несвязанных катионов и добавьте 9 мл астроцитарной среды.
- Для приготовления мозгов добавьте 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в 1x 10 см чашки Петри и 1 мл HBSS в 1x 15 мл пробирки (независимо от количества мозгов, которые будут использоваться). Держите в пределах досягаемости хирургические ножницы, 2 тонких щипца и бинокль для проведения процедуры.
- Быстро обезглавьте 3 щенков хирургическими ножницами и соберите головы в пустую 10-сантиметровую посуду.
- Выполните подготовку коры головного мозга под бинокль. С помощью двух тонких щипцов удалите спинную кожу черепа по средней линии, начиная от шеи вверх к уровню глаз. После этого мозг с его кровеносными сосудами виден под черепом.
- Зафиксируйте голову на ростральном конце с помощью щипцов и надрежьте среднюю линию черепа, начиная с заднего конца. Затем отрежьте правую и левую половины черепа, чтобы обнажить мозг.
- Закройте кончик щипцов и расположите его вентрально под мозгом. Извлеките мозг из черепа и перенесите его в заполненную HBSS 10-сантиметровую чашку Петри. Продолжайте таким же образом с оставшимся образцом, пока все мозги не будут собраны в чашке.
- После сбора мозгов начните с разделения коры головного мозга, отщипнув задний мозг с помощью щипцов, похожих на ножницы. Выполните разрез по средней линии между двумя полушариями с помощью одной пары щипцов. Аккуратно зафиксируйте мозг с помощью щипцов и отрежьте средний мозг и обонятельные луковицы с помощью вторых щипцов, чтобы в конечном итоге получить корковые половины.
- Зафиксируйте одну кортикальную половинку с помощью одной пары щипцов и отсоедините мозговые оболочки от полушарий, отделив их от бокового края и впоследствии оттянув их от поверхности коры с помощью вторых щипцов.
- Переверните кортикальную половину так, чтобы ее поверхность была направлена вниз к блюду; тщательно рассеките и удалите гиппокамп в форме полумесяца с помощью одной пары щипцов. Перенесите отдельные кортикальные пучки в коническую трубку объемом 15 мл с помощью одного закрытого щипца для переноса индивидуальной коры.
- После сбора всей коры головного мозга переходят к стерильному ламинарному проточному колпаку и начинают с подготовки к диссоциации корковой ткани.
- Добавьте 1 мл DMEM в реакционную пробирку объемом 2 мл и добавьте 0,1% мас.% папаина (30 ЕД). Инкубировать суспензию на водяной бане при температуре 37 °C до образования осветленного раствора (около 3 мин). Добавьте 0,24 мг/мл L-цистеина и 20 мкг/мл ДНКазы и осторожно встряхните.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пищеварения необходимо примерно 1 мл ферментного раствора.
- Фильтруйте (размер пор 0,22 мкм) для получения 1 мл стерильного раствора перед добавлением его в ткань коры головного мозга. Инкубировать пробирки в течение 30 мин - 1 ч при 37 °C (т.е. на водяной бане).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.11 - 1.14 являются критически важными и должны быть выполнены в течение 15 минут.
- Чтобы прекратить реакцию пищеварения, добавьте 1 мл астроцитарной среды и тщательно растирайте переваренную ткань с помощью пипетки объемом 1 мл. Для растирания осторожно перемещайте поршень пипетки, тем самым аспирируя и выдавливая суспензию кортикальной ткани.
- После того, как ткань была диссоциирована в одноклеточную суспензию, добавьте 5 мл астроцитарной среды и центрифугируйте в течение 5 минут при 216 x g.
- Осторожно отасканируйте надосадочную жидкость из полученной гранулы и ресуспендируйте клетки в среде с концентрацией 1 мл астроцитов.
- Добавляйте клеточные суспензии в колбы Т75, обогащенные средой с 9 мл астроцитов (см. 1.2).
- Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе в присутствии 6% v/vCO2. Через 4 дня выполните первую полную смену среды (10 мл). После этого меняйте питательную среду каждые 2 - 3 дня.
- Через 7 дней проверьте, не образовался ли в клетках сливающийся монослой. Если нет, подождите еще 2 - 3 дня, пока не будет достигнуто полное слияние культуры.
Примечание: Астроциты имеют большие, уплощенные клеточные тела, локализуются на дне колбы и не развивают заметных клеточных процессов. Они отличаются от небольших фазово-контрастных ярких клеток-предшественников и микроглии, находящейся поверх монослоя.
- Чтобы избавиться от клеток-предшественников и получить чистую культуру астроцитов, поместите колбы Т75 на орбитальный шейкер и встряхните культуры O/N со скоростью 250 об/мин. Убедитесь, что температура отрегулирована до 37 °C, а фильтр колбы закрыт лабораторной пленкой, чтобы предотвратить испарение CO2.
- На следующий день отсадить среду и добавить 10 мл свежей питательной среды, обогащенной 20 мкМ цитозин-1-β-D-арабинофуранозидом (AraC) для устранения остаточных делений клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: инкубация с AraC в течение 2 - 3 дней в инкубаторе при 37 °C, 6%CO2 приведет к получению чистой культуры астроцитов.
- Контролируйте чистоту культур астроцитов путем визуального осмотра под световым микроскопом. Если остаточные фазово-контрастные яркие клетки-предшественники и микроглия все еще находятся на вершине астроцитарного монослоя (см. шаг 1.16), повторите шаги 1.18 и 1.19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сливающиеся и чистые монослои астроцитов можно поддерживать в инкубаторе до 14 дней (37 °C, 6% v/vCO2) перед переходом к следующему этапу. Меняйте половину носителя каждые 3 дня. Не собирайте, не замораживайте и не размораживайте астроциты, так как эти клетки потеряют свои нейронные поддерживающие свойства в процессе хранения.
2. Подготовка астроцитов к непрямой кокультуре
ПРИМЕЧАНИЕ: за 48 - 72 часа до подготовки нейронов перенесите астроциты во вставки для клеточных культур. Как правило, одна колба Т75 доставляет достаточное количество клеток для поддержки культур нейронов, полученных с помощью одного препарата.
- Поместите столько вкладышей, сколько нужно, в 24-луночные пластины. Нанесите на каждую вставку 10 мкг/мл PDL (растворенного в воде, пригодной для клеточных культур) в течение примерно 1 ч при 37 °C, 6% v/v CO2. После инкубации дважды промойте вкладыши PBS. Тем временем приступайте к подготовке астроцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладыши, заполненные PBS, можно хранить до тех пор, пока суспензия астроцитарных клеток не будет готова к использованию.
- Отсадите астроцитарную среду (с AraC) и промойте культуру один раз 10 мл PBS, чтобы убедиться, что остатки сыворотки удалены.
- Добавьте 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в колбы и инкубируйте клетки для трипсинизации при 37 °C, 6% v/vCO2 в течение примерно 10 минут.
- Контролируйте отслоение клеток путем визуального осмотра с помощью микроскопа и облегчайте отслоение ячеек, постукивая боковыми стенками колб о рабочий стол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.5 - 2.8 являются критически важными и должны быть завершены в течение 15 - 20 минут.
- После трипсинизации аккуратно суспендируйте клетки в среде астроцитов объемом 7 мл и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 216 x g.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде с концентрацией 1 мл астроцитов.
- Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры.
- Заполните дно лунок 24-луночного планшета средой с 500 мкл астроцитов и перенесите 25 000 клеток в среде астроцитов 500 мкл в каждую отдельную вставку. Инкубировать культуру при 37 °C, 6% v/v CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 42 - 72 ч культуры достигнут примерно 100% конфлюенции. На этом этапе чистота культуры может быть проверена с помощью иммуноцитохимии. Слияние культур можно сохранять до 7 дней до перехода к следующему этапу. Меняйте половину среды каждые 3 дня.
3. Подготовка первичных нейронов гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные нейроны гиппокампа мыши должны быть получены из эмбрионов E15.5 - E16 беременных мышей.
- Приготовьте нейронную среду (МЭМ с 10 мМ пирувата натрия, 0,1% овальбумина, 2% v/v добавки среды B27 и 0,1% v/v гентамицина (стерильно отфильтрованного)) и подготовительную среду (HBSS с 0,6% w/v глюкозы и 10 mM HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновая кислота)). Предварительно нагрейте и уравновесьте нейронную среду в фильтрующих колбах при 37 °C, 6% v/vCO2.
- Поместите стеклянные покровные стекла (диаметром 12 мм) в лунки 24-луночных планшетов (используйте специальные покровные стекла, которые имеют насечки для использования со вставками для клеточных культур).
- Нанесите на поверхность не менее 1 ч 15 мкг/мл поли-DL-орнитин в воду (для клеточных культур) при температуре 37 °C. Используйте не менее 500 мкл на лунку, чтобы убедиться, что покровные стекла полностью покрыты. Дважды промойте лунки PBS. Оставьте ПБС в лунках до нанесения покрытия на ячейки. Следите за тем, чтобы лунки не пересыхали.
- Чтобы вскрыть гиппокамп, приготовьте 3 блюда по 10 см, наполненные подготовительной средой, и 1 пробирку объемом 2 мл с 1 мл подготовительной среды. Подготовьте ножницы и 2 тонких щипца.
- Принесите беременную мышь в жертву при вывихе шейки матки, простерилизуйте брюшную полость, промыв 70% v/v этанолом, и вскройте брюшную полость острыми ножницами. Тщательно иссеките вырезанную из бусин матку ножницами и переложите орган в посуду размером 1 х 10 см, наполненную подготовительной средой.
- Далее извлеките эмбрионы из матки. Осторожно разрежьте матку и удалите амнион, не причиняя вреда эмбрионам, с помощью 2 щипцов. После этого обезглавьте каждый эмбрион ножницами и переложите головы во вторую 10-сантиметровую посуду, снабженную подготовительной средой.
- Приступайте к подготовке кочанов (аналогично подготовке, описанной в 1.4 – 1.7).
- Обездвижите голову с помощью пары щипцов и разрежьте череп и кожу в области шеи ближе к заднему мозгу, перпендикулярно нейраксису. Используйте вторую пару щипцов, чтобы приподнять череп и покровную кожу, и согните мягкую тюбетейку к ростральному концу головы, тем самым обнажив мозг.
- С помощью 2 щипцов отделите мозг от полости черепа. Для этого закройте 1 пару щипцов и отделите мозг от черепа, начиная с обонятельных луковиц и двигаясь по направлению к заднему мозгу. Соберите мозги в другую 10-сантиметровую посуду, наполненную подготовительной средой.
- Отделите гиппокамп от фрагментов коры головного мозга, как описано выше для получения астроцитов (шаг 1.6). Удалите гиппокампы с каждого полушария и соберите их в пробирку объемом 2 мл, заполненную подготовительной средой.
- После завершения диссекции перенесите трубку на стерильную скамью ламинарного потока и расщепите ткань гиппокампа раствором для пищеварения объемом 1 мл, содержащим папаин. Приготовьте раствор для дигезирования, как описано в шагах 1.9 - 1.10, но используйте MEM вместо DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.9 - 3.12 являются критически важными и должны быть выполнены в течение 10 - 15 минут.
- После завершения разложения осторожно вывести раствор для вареживания путем осторожного отсасывания с помощью пипетки.
- Промойте гиппокамп 3 раза нейронной средой, последовательно добавляя, а затем тщательно отсасывая 1 мл свежей питательной среды за цикл мытья. Не центрифугируйте клеточную суспензию.
- После заключительного этапа промывания тщательно растирайте салфетку в 1 мл нейронной среды.
- Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры и наберите 35 000 клеток в среде нейронов объемом 500 мкл в одной лунке 24-луночной пластины (пластина, упомянутая в пункте 3.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, аликвота клетки может быть окрашена трипановым синим для оценки жизнеспособности клеточного препарата. Контролируйте плотность покрытия путем визуального осмотра с помощью микроскопа (обычно 90 - 110 клеток на поле зрения стандартного объектива 10X).
- Поместите нейроны в инкубатор при температуре 37 °C, 6% v/vCO2 в течение 1 ч.
- После инкубации выньте подготовленные вкладыши (засеянные сливающимися монослоями астроцитов) из инкубатора (см. пункт 2.8). Замените среду путем аспирации астроцитарной среды и замены ее 500 μл свежей нейронной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладыши должны содержать сливающиеся монослои астроцитов через 2 - 3 DIV (дней in vitro).
- С помощью стерильных щипцов осторожно поместите вкладыши с астроцитами в лунки, содержащие культуры нейронов (шаг 3.13).
- Полученную совместную культуру непрямых нейронов и астроцитов поместите обратно в инкубатор при температуре 37 °C, 6% v/v CO2,
Примечание: В этих условиях нейроны можно культивировать до 4 недель в полностью определенной среде. Смена среды не требуется. Для культур длительного хранения рекомендуется заполнять пустые лунки стерильной водой, чтобы уменьшить испарение с 24-луночной пластины.
