Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Вскрытие мозга крысы или мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать как мышей, так и крыс. Также можно использовать животных старше P8 (мы тестировали до P12), но удаление мозговых оболочек будет становиться все более трудным. Кроме того, выход клеток и их здоровье уменьшатся, поскольку в клетках мозга старых животных будут формироваться сложные процессы и связи, которые могут разорваться во время диссоциации тканей, что приведет к увеличению гибели клеток. Препараты коры головного мозга описаны здесь, но могут быть использованы и другие участки мозга.
- Поместите 0,05% трипсин-ЭДТА в водяную баню при температуре 37 °C.
- Усыпляйте животных (беременных крыс для щенков E19 или животных P0-P8) путем медленного повышения концентрацииCO2 и изоляции мозга. Следующие шаги требуют стерильной техники.
- Если вы работаете с эмбриональными тканями, сначала удалите эмбрионы из матки и вскройте эмбриональные мешочки, затем сразу же отрежьте головки ножницами. Когда все головки будут срезаны, перенесите их в предварительно охлажденную среду для препарирования.
- Как только головы будут погружены в среду, вскройте кожу и череп (и то, и другое очень мягкое у молодых животных) с помощью щипцов и отщипните мозжечок. Осторожно поднимите остальную часть мозга вверх и выведите ее из черепа.
заметка: От двух до четырех эмбрионов E19 дают достаточно ткани, по крайней мере, для восьми 10-сантиметровых тарелок кортикальных астроцитов, содержащих 500 000 клеток на чашку в день вскрытия.
- У новорожденных или более взрослых щенков отрежьте головы ножницами и изолируйте мозг, медиально разрезая кожу по прямой линии от затылка до кончика носа. Оттяните кожу в сторону и аккуратно разрежьте череп влево и вправо, затем поднимите кость черепа вверх. Отрежьте мозжечок, а остальную часть мозга поднимите вверх и выведите из черепа.
заметка: Две-три детеныша P0-P8 дают достаточно ткани, по крайней мере, для восьми 10-сантиметровых чашек кортикальных астроцитов, содержащих 500 000 клеток на чашку в день вскрытия.
- Отделите кору головного мозга от основной структуры среднего мозга. Поместите щипцы в продольную щель между полушариями, затем переместите щипцы между структурами коры и среднего мозга одного полушария (перпендикулярно продольной щели), чтобы освободить каждое полушарие.
- С помощью щипцов удалите все мозговые оболочки с каждого полушария (и его гиппокампа), затем отделите гиппокамп. Если требуются астроциты гиппокампа, переместите каждый гиппокамп в пробирку объемом 15 мл, заполненную 14 мл диссекционной средой на льду.
- Удалите дополнительные участки коры головного мозга каждого полушария, если требуются определенные области (например, лобная кора). Разрежьте любую кортикальную ткань, которая будет использоваться для получения астроцитов, на куски размером не более 1 мм3. Соберите все кусочки корковой ткани в отдельную пробирку объемом 15 мл, заполненную средой для рассечения на льду.
2. Переваривание и диссоциация тканей
- Как только все кусочки ткани будут собраны, подождите, пока они осядут на дно трубки, затем аспирируйте как можно больше среды.
- Добавьте 2-3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА с помощью серологической пипетки и инкубируйте пробирки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 мин.<бр/>
заметка: Быстро выпустите весь трипсин-ЭДТА из пипетки, чтобы перемешать кусочки ткани и дать им снова осесть.
- Осторожно аспирируйте трипсин-ЭДТА, оставляя кусочки ткани в как можно меньшем количестве жидкости на дне трубки.
- Добавьте 5 мл предварительно охлажденной среды для вскрытия, чтобы смыть остатки трипсина-ЭДТА. Подведите пипетку сбоку от верхней части пробирки, чтобы добиться перемешивания кусочков ткани.
- Отсадите диссекционную среду и оставьте кусочки ткани в как можно меньшем количестве жидкости. Повторите этот этап промывки с предварительно охлажденной средой для рассечения еще дважды.
- После заключительного этапа промывки добавьте 1 мл DMEM+ (подогретого до комнатной температуры) с помощью наконечника для пипетки объемом 1 000 мкл и растирайте ткань, пипетируя вверх и вниз без образования пузырьков><.
заметка: Важно избегать образования пузырьков, так как это может изменить pH раствора, к которому астроциты достаточно чувствительны.
- Поместите клеточный фильтр 100 μм в отверстие пробирки объемом 50 мл и предварительно смочите фильтр 4,5 мл предварительно охлажденного DMEM+.
- Нанесите пипеткой 1 мл диссоциированной тканевой суспензии на клеточный фильтр и добавьте еще 4,5 мл предварительно охлажденного DMEM+, чтобы промыть клетки через клеточный фильтр.
3. Пропускание клеток
- За день до пассирования обмазывают клеточные культуральные планшеты 0,04% PEI.
- На 7-й день после вскрытия поместите 10-сантиметровые чашки с клетками в DMEM+ на лабораторный шейкер в инкубаторе и встряхивайте чашки при 110 об/мин в течение 6 часов.
- Дважды смойте PEI с покровных стекол с покрытием деионизированной дистиллированной водой. Добавьте в планшеты среду NB+H (500 мкл на лунку для 24-луночных планшетов и 2 мл на лунку для 6-луночных планшетов). Предварительно уравновесьте пластины в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2, пока посуда диаметром 10 см встряхивается, или не менее 30 минут.
- За 20-30 минут до окончания 6-часового встряхивания предварительно разогреть 1x PBS, DMEM+, NB+H и 0,25% трипсин-ЭДТА до 37 °C на водяной бане.
- После 6 часов встряхивания снимите питательные чашки с шейкера и немедленно замените среду (содержащую отряхнутые нейроны, олигодендроциты и микроглию) 10 мл предварительно подогретой 1x PBS на чашку><.
заметка: Важно немедленно аспирировать старую среду, содержащую отделенные клетки, чтобы избежать повторного прикрепления неастроцитарных клеток.
- Удалите PBS и добавьте 3 мл предварительно подогретого трипсина-ЭДТА на блюдо. Инкубировать каждую чашку в течение 4 минут в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2
- Добавьте 5 мл предварительно подогретого DMEM+ к 3 мл трипсина-ЭДТА в каждой чашке, отведите клетки от чашки пипеткой с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
заметка: Пипетка прямо со дна посуды – пол посуды должен стать более чистым по мере отделения ячеек. Используйте только сывороткосодержащую среду (вместо DMEM+), так как сыворотка инактивирует трипсин.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 3 220 x g при 20 °C в течение 4 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл предварительно подогретой NB+H.
4. Покрытие клеток для окончательных культур астроцитов
- Посчитайте клетки.
- Планшет 20 000 клеток на лунку в 6-луночных планшетах (в среде 2 мл NB+H на лунку) или 5 000 клеток на лунку в 24-луночных планшетах (в среде 500 μL NB+H на лунку).
- Клеточные культуры следует хранить в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 до дальнейшей обработки или анализа.
