Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в нейроны на микроэлектродных матрицах

Аннотация

Источник: Frega, M., et al., Быстрая дифференцировка нейронов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для измерения сетевой активности на микроэлектродных массивах. J. vis. Exp. (2017)

Видео демонстрирует метод генерации возбуждающих корковых нейронов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs). При индукции доксициклина ИПСК сверхэкспрессируют нейрогенин-2, нейроспецифический фактор транскрипции. Используя специфические среды и совместное культивирование с астроцитами, этот процесс облегчает дифференцировку ИПСК в нейроны с синаптическими связями.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Дифференциация rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs в нейроны на 6-луночных MEA и стеклянных покровных стеклах

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе представлены детали для дифференциации rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs на двух разных подложках, т.е. 6-луночных MEA (устройства, состоящие из 6 независимых лунок с 9 записывающими и 1 референтными встроенными микроэлектродами на лунку) и стеклянных покровных стеклах в лунках 24-луночного планшета.....

Результаты

Рисунок 1: Дифференцировка hiPSC в нейроны. A. Три временные точки дифференцировки ИПСК в нейроны на покровных листах. В. Покрытие гиПСК на МЭА. В. Астроциты при 100% слиянии в колбе Т75 (обратите внимание, что клетки образуют мозаичный монослой). Масштабные линейки: 150 μм.

....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Добавка к B-27	Gibco	0080085СА
Не содержащий Ca2+/Mg2+ HBSS	Gibco	14175-095
0,05 % Трипсин-ЭДТА	Gibco	No 25300-054
2,5 % трипсин	Gibco	15090-046
Высокоглюкозный DMEM	Gibco	11965-092 Номер 11965-092
ФБС	Сигма-Олдрич	Ф2442-500МЛ
Пенициллин/стрептомицин	Сигма-Олдрич	П4333
Сетчатый фильтр 70 μм	BD Falcon	No 352350 (Английский
ДПБС	Gibco	14190-094
Матрица базальной мембраны	Gibco	A1413201
DMEM/F12	Gibco	11320-074 (Английский)
Решение для отслойки клеток	Сигма-Олдрич	А6964
E8 средний	Gibco	A1517001
Ингибитор ROCK	Gibco	A2644501	В качестве альтернативы можно использовать ингибиторы ROCK, такие как тиазовивин.
6-луночные МПС	Многоканальные системы	60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
Стеклянные покровные стекла	ВВР	Тел.: 631-0899
Поли-L-орнитин	Сигма-Олдрич	П3655-10МГ
Ламинин	Сигма-Олдрич	Л2020-1МГ
Доксициклин	Сигма-Олдрич	D9891-5G
Дополнение N-2	Gibco	17502-048
Заменимые аминокислоты	Сигма-Олдрич	М7145
NT-3, рекомбинантный для человека	Промокин	С66425
BDNF, человеческий рекомбинант	Промокин	С66212
Трипсин-ЭДТА	Gibco	No 25300-054
Нейробазальная среда	Gibco	No 21103-049
Цитозин β-D-арабинофуранозид	Сигма-Олдрич	С1768-100МГ

)