$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Дифференциация rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs в нейроны на 6-луночных MEA и стеклянных покровных стеклах
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе представлены детали для дифференциации rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs на двух разных подложках, т.е. 6-луночных MEA (устройства, состоящие из 6 независимых лунок с 9 записывающими и 1 референтными встроенными микроэлектродами на лунку) и стеклянных покровных стеклах в лунках 24-луночного планшета. Протоколы, однако, могут быть легко адаптированы для более крупных субстратов (например, для лунок с 12- или 6-луночными планшетами) путем масштабирования указанных значений в зависимости от площади поверхности.
- Подготовьте MEA или стеклянные покровные листы (день 0 и день 1)
- За день до начала дифференциации простерилизовать МЭА в соответствии с рекомендацией производителя.
- Разведите белок адгезии поли-L-орнитин (PLO) в стерильной ультрачистой воде до конечной концентрации 50 мкг/мл. Покрыть площадь активного электрода 6-луночных МЭА, поместив в каждую лунку каплю разбавленного PLO объемом 100 мкл. Поместите покровные стекла в лунки 24-луночного планшета с помощью стерильного пинцета. Добавьте по 800 мкл разведенного PLO в каждую лунку. Чтобы покровные стекла не всплывали, надавите на них с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 μл.
- Инкубируйте 6-луночные МЭА и 24-луночные планшеты O/N в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2. На следующий день аспирируйте разведенный ПЛО. Дважды промойте стеклянные поверхности 6-луночных MEA и покровных стекол стерильной сверхчистой водой.
- Развести ламинин в холодном DMEM/F12 до конечной концентрации 20 г/мл (для 6-луночных МЭА) и 10 г/мл (для стеклянных покровных стекол). Немедленно покройте активную электродную зону 6-луночных МЭА, поместив каплю объемом 100 мкл в каждую лунку. Аналогичным образом добавьте 400 мкл разведенного ламинина в каждую лунку 24-луночного планшета, чтобы покрыть покровные стекла. Чтобы покровные стекла не всплывали, нажмите на них с помощью наконечника для дозатора объемом 1 000 μл.
- Инкубируйте 6-луночные МЭА и 24-луночный планшет в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с атмосферой 5%CO2 в течение не менее 2 часов.
- Нанесите на пластину гиПСК (день 1)<бр />
Примечание: Объемы, упомянутые на этапах 3.2.1 - 3.2.4, предполагают, что rtTA/Ngn2-положительные ИПСК культивируются в 6-луночном планшете и что собираются клетки одной лунки. Объемы, необходимые для гальванизации ТОТЭ на 6-луночных МПС и/или покровных стеклах, зависят от количества 6-луночных МПС и/или количества покровных покрытий, используемых в эксперименте; Числа, указанные на шагах 3.2.6 - 3.2.8, позволяют масштабировать эксперимент на разные размеры.
- Подогрейте среду DMEM/F12, CDS и E8 1% (v/v) пенициллин/стрептомицин до R/T. Добавьте доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл и ингибитор ROCK к среде E8.
- Аспирируйте отработанную среду rtTA/Ngn2-положительных hiPSCs и добавьте 1 мл CDS к hiPSCs. Инкубировать 3 - 5 минут в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2. Проверьте под микроскопом, не отделяются ли клетки друг от друга.
- Добавьте 2 мл DMEM/F12 в лунку, аккуратно подвесьте клетки с помощью пипетки объемом 1000 мкл и переложите клетки в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 7 мл DMEM/F12 в клеточную суспензию. Вращайте ячейки при 200 x g в течение 5 минут.
- Отсадите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл приготовленной среды Е8. Диссоциируйте ИПСК путем приложения кончика пипетки объемом 1000 мкл к боковой стороне пробирки объемом 15 мл и осторожного суспендирования клеток. Проверьте под микроскопом, не диссоциированы ли клетки.
- Определите количество клеток (клеток/мл) с помощью камеры гемоцитометра.
заметка: Лунка с 6 лунками с конфлюенцией 80 - 90% обычно дает в общей сложности 3,0 - 4,0 x 106 клеток.
- Отсадите разведенный ламинин. Для 6-луночных МЭА разбавляют клетки до получения клеточной суспензии 7,5 x 105 клеток/мл. Пластинчатую обработку элементов путем добавления капли 100 мкл суспензии элемента на активную электродную область в каждой лунке 6-луночных MEA. Для покровных стекол разбавьте клетки до получения клеточной суспензии 4,0 x 104 клеток/мл. Пластинируйте ячейки, добавив 500 мкл клеточной суспензии в лунки 24-луночного планшета.
заметка: Конечная плотность ячеек на MEA выше, чем на покровных стеклах (рис. 1A и B). Мы обнаружили, что такая высокая плотность ячеек была необходима для правильной регистрации сетевой активности. В протоколе указываются цифры, которые были оптимальными для проведения анализов.
- Поместите 6-луночные МЭА и 24-луночный планшет в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2 на 2 ч (MEAs) или O/N (24-луночный планшет).
- Через 2 ч осторожно добавьте по 500 мкл подготовленной среды E8 в каждую лунку из 6-луночных MEA. Поместите 6-луночные MEA O/N в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2.
- Смена среды (день 2)
- На следующий день приготовьте DMEM/F12 с 1% (v/v) добавкой N-2, 1% (v/v) заменимых аминокислот и 1% (v/v) пенициллином/стрептомицином. Добавьте человеческий рекомбинантный нейротрофин-3 (NT-3) до конечной концентрации 10 нг/мл, человеческий рекомбинантный нейротрофический фактор мозга (BDNF) до конечной концентрации 10 нг/мл и доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл. Нагрейте среду до 37 °C.
- Добавьте ламинин до конечной концентрации 0,2 мкг/мл в среду. Полученную среду процедите. Отсадите отработанную среду из лунок 6-луночных МЭА и 24-луночной тарелки и замените ее подготовленной средой. Инкубируйте 6-луночные МЭА и 24-луночные планшеты O/N в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2.
- Добавить крысиные астроциты (день 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы, которые упоминаются в этом протоколе, предполагают, что астроциты крыс культивируются в колбах для культуры T75. Крайне важно, чтобы астроциты крыс, которые добавляются в культуры, были хорошего качества. Мы используем два критерия, чтобы проверить, имеют ли крысиные астроциты хорошего качества. Во-первых, культура астроцитов крысы должна быть способна сливаться в течение десяти дней после выделения из эмбрионального мозга крысы. Во-вторых, после расщепления культуры астроцитов крысы астроциты должны быть способны образовывать сливающийся, мозаичный монослой (рис. 1C). Если культура астроцитов крысы не удовлетворяет этим двум критериям, мы не советуем использовать эту культуру для экспериментов по дифференцировке.
- Нагрейте 0,05% трипсин-ЭДТА до ЛТ. Нагрейте DPBS и DMEM/F12 с 1% (v/v) пенициллином/стрептомицином до 37 °C.
- Аспирируйте отработанную среду культуры астроцитов крысы. Промойте культуру, добавив 5 мл DPBS, и аккуратно прополощите ее.
- Аспирируйте DPBS и добавьте 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Осторожно взбейте трипсин-ЭДТА. Инкубировать в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C и атмосферой 5%CO2 в течение 5 - 10 минут.
- Проверьте под микроскопом, не оторвались ли клетки. Отделите последние ячейки, ударив по колбе несколько раз.
- Добавьте в колбу 5 мл DMEM/F12. Аккуратно растирайте клетки внутри колбы с помощью пипетки объемом 10 мл. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Вращайте трубку при давлении 200 x g в течение 8 минут.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл DMEM/F12. Определите количество клеток (клеток/мл) с помощью камеры гемоцитометра.
- Добавьте 7,5 x 104 астроцита в лунку 6-луночного MEA. Добавьте 2,0 x 104 астроцита в лунку 24-луночного планшета. Инкубируйте MEA и 24-луночный планшет O/N в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с атмосферой 5%CO2.
- Смена среды (день 4)
- Приготовьте нейробазальную среду с 2% (v/v) добавки B-27, 1% (v/v) L-аланил-L-глутамина и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина. Добавьте NT-3 до конечной концентрации 10 нг/мл, BDNF до конечной концентрации 10 нг/мл и доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл. Кроме того, добавляют цитозин β-D-арабинофуранозид в концентрации 2 мкМ.<бр/>
Цитозин β-D-арабинофуранозид добавляется в среду для ингибирования пролиферации астроцитов и уничтожения оставшихся ИПСК ИПСК которые не дифференцируются в нейроны.
- Отфильтровать среду и нагреть до 37 °С. Отсадить отработанную среду из лунок 6-луночных МЭА и 24-луночной плиты и заменить ее подготовленной средой. Поддерживайте 6-луночные МЭА и 24-луночный планшет в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и атмосфере 5%CO2.
- Освежите среду (день 6 - 28)
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с 6-го дня, обновляйте половину носителя каждые два дня. Начиная с 10-го дня, среда дополняется FBS для поддержания жизнеспособности астроцитов.
- Приготовьте нейробазальную среду с 2% (v/v) добавки B-27, 1% (v/v) L-аланил-L-глутамина и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина. Добавьте NT-3 до конечной концентрации 10 нг/мл, BDNF до конечной концентрации 10 нг/мл и доксициклин до конечной концентрации 4 мкг/мл. Начиная с 10-го дня, также добавляйте в среду 2,5% (v/v) FBS. Полученную среду процедите и прогрейте ее до 37 °C.
- Удалите половину отработанной среды из лунок 6-луночных МЭА и 24-луночного планшета с помощью пипетки объемом 1000 мкл и замените ее подготовленной средой. Поддерживайте 6-луночные МЭА и 24-луночный планшет в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и атмосфере 5%CO2.
