Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка нейронных шариков в виде культуры висячих капель (Дни in vitro (DIV) 0-3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь процедуры подготовки культуры нейронных шариков основаны на методе, ранее описанном группой Сасаки, с некоторыми модификациями. Мы также переняли несколько процедур из метода банкира для диссоциированной культуры.
- Подтверждение следующего перед началом вскрытия
- Заранее приготовьте все необходимые растворы и простерилизуйте их методом автоклава/фильтрации.
- Держите наготове все инструменты и материалы, которые будут использоваться на каждом этапе этой культуры корковых нейронов.
- Распылите и протрите шкаф с ламинарным потоком воздуха, стол для вскрытия, сценическую пластину стереомикроскопа, ножницы и щипцы с 70% этанолом.
- Усыпьте мышь после введения CO2 и рассеките брюшную полость, чтобы получить эмбрионы E16.
- Осторожно извлеките мозги эмбрионов с помощью тонких кончиков щипцов и перенесите их в 60 мм чашки для клеточных культур, содержащие 4 мл 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновой кислоты, буферизованный раствор соли HEPES (HBSS). <бр/>
заметка: Среда для вскрытия HBSS содержит 10 мМ HEPES (pH 7,4), 140 мМ хлорида натрия (NaCl), 5,4 мМ хлорида калия (KCl), 1,09 мМ дигидрофосфата натрия (Na2HPO4), 1,1 мМ дигидрофосфата калия (KH2PO4), 5,6 мМ D-глюкозы и 5,64 мкМ фенола красного.
- Снимите волосистую часть головы, разрежьте обонятельную луковицу, отделите кору головного мозга от каждого полушария головного мозга с помощью тонких кончиков щипцов под стереомикроскопом и переложите в другую 60-миллиметровую посуду, содержащую свежий HBSS. Используйте не менее 3-5 эмбрионов для каждой отдельной культуры нейронного шарика.
- Разрежьте кору на небольшие кусочки с помощью микрорассекающих пружинных ножниц в ламинарном проточном капюшоне для клеточной культуры.
- Перенесите измельченный кортикальный слой в пробирку объемом 15 мл и трипсинизируйте измельченный кортикальный слой в 4 мл 0,125% трипсина в HBSS в течение 4,5 мин на водяной бане при 37 °C.
заметка: Это время трипсинизации имеет решающее значение для эффективной культуры нейронов, так как увеличение времени (> 4,5 минут) приводит к гораздо большему количеству мертвых нейронов.
- Перенесите клеточные агрегаты в новую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл HBSS, с помощью стерильной пипетки для переноса и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 5 мин. Повторите этот шаг еще раз.
- Перенесите клеточные агрегаты в новую пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл нейробазальной среды, содержащей GlutaMax, добавку B27 (среда NGB), 0,01% ДНКазы I и 10% лошадиной сыворотки.
- Растирайте трипсинизированные коры головного мозга путем многократного пипетирования вверх и вниз (3-5 раз) с помощью пипетки Пастера из тонкого стекла, отполированного огнем.
заметка: Диаметр пипетки Пастера из тонкого стекла с огненной полировкой очень важен, как описано в статье по методу Банкера. Если пипетка слишком узкая для прохождения коры, подготовьте пипетки, обладающие 2-3 разными размерами, и попробуйте использовать пипетку большего размера.
- Для приготовления нейронных шариков возьмите вышеуказанную клеточную суспензию и отрегулируйте плотность клеток до 1 х 106 клеток/мл с помощью среды NGB.
- Культивируйте корковые нейроны в виде висячих капель, содержащих 10 000 клеток/каплю (1 капля равна 10 мкл) внутри верхних крышек 10-сантиметровых посуд.
- Добавьте 7 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в нижнюю часть питательных чаш, затем выдержите в инкубаторе в течение 3 дней при 37 °C с 5%CO2 в увлажненных условиях, чтобы обеспечить образование нейронного шара.
