$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Культуральный препарат диссоциированного ганглия дорсального корешка взрослого человека или нейрона DRG
- Перед установкой культуры предварительно покройте 6-луночный планшет поли-D-лизином и ламинином. Инкубируйте 6-луночный планшет с 0,01% поли-D-лизина при 37°C в течение 2 ч или при 4°C в течение ночи. Затем дважды промойте тарелку дистиллированной водой.
- Инкубировать пластину с раствором ламинина в концентрации 3 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дважды промыть пластину дистиллированной водой. Сушите тарелку при комнатной температуре не менее 1 часа.
- Усыпьте мышь в прозрачной камере CO2, подключенной к баллону со сжатым газом CO2. Надрежьте кожу, лежащую над позвоночным столбом, хирургическим лезвием и рассеките паравертебральные мышцы с обеих сторон, чтобы обнажить позвоночные кости. Тщательно удалите кости позвонков с помощью хирургического наконечника с узким наконечником до тех пор, пока DRG не будут полностью открыты.
заметка: Взрослые нейроны DRG получены от взрослых самцов мышей C57BL6 в возрасте от 8 до 12 недель.
- Удалите DRG двусторонне от S1 до уровня C1 с помощью иридэктомических ножниц и щипцов с тонкими наконечниками под микроскопом. Постарайтесь полностью вырезать корни из DRG, чтобы свести к минимуму загрязнение шванновских клеток или фибробластов.
- Храните препарированные DRG в чашке Петри диаметром 60 мм, содержащей 5 мл холодной модифицированной Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) на льду до тех пор, пока все DRG не станут следующим шагом, даже если все еще будут собраны оставшиеся DRG><.
заметка: Крайне важно как можно быстрее расчленить ДРГ. Сбор всех DRG с одной мыши не должен занимать более 30 мин. 30 мин после эвтаназии, прекратите сбор DRG и перейдите к переносу DRG в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл с помощью синего наконечника для дозатора (1000 μл) с отрезанным концом. Извлеките DMEM после быстрого отжима в течение нескольких секунд с помощью мини-центрифуги. Добавьте 1 мл DMEM, содержащего 125 ЕД/мл коллагеназы типа XI, и инкубируйте пробирку в течение 90 мин с легким вращением (35-40 об/мин) с помощью шейкера твистера в инкубаторе при температуре 37 °C. Иммобилизуйте трубку на полу шейкера с помощью ленты.
- Откажитесь от коллагеназы, содержащей DMEM, и добавьте 1 мл свежего DMEM. Дождитесь, пока плавающие ДРГ полностью опустятся на дно, а затем удалите DMEM вместе с остатками ткани. Повторите этот этап стирки не менее шести раз.
заметка: Не пытайтесь полностью отказаться от надосадочной жидкости. Будьте осторожны, чтобы не удалить какие-либо DRG с помощью надосадочной жидкости DMEM.
- Перенесите DRG в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью синего наконечника для дозатора (1000 μл) с обрезанным концом. Затем осторожно проводите пипеткой вверх и вниз не менее 15 раз с помощью синего наконечника (1000 мкл), чтобы получить однородную клеточную суспензию. Избегайте образования пузырей и старайтесь не касаться дна конической трубки наконечником пипетки.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 239 x g в течение 3 минут и осторожно выбросьте надосадочную жидкость с плавающим мусором. Добавьте 1 мл нейробазальной среды с добавлением B27 (2,0% v/v) и ресуспендируйте клеточную гранулу путем осторожного пипетирования вверх и вниз от 5 до 10 раз.
- Пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр толщиной 70 мкм, наложенный поверх конической трубки объемом 50 мл. Подождите 2 минуты, а затем налейте среду Neurobasal/B-27 на ситечко с помощью контроллера пипетки.
- Пластину всех собранных нейронов DRG (примерно 2 x 10 нейронов6 DRG от одной мыши) на две лунки 6-луночной пластины. Нейроны DRG одной взрослой мыши покрывают две лунки в 6-луночной пластине. Затем поместите планшет в инкубатор сCO2 при температуре 37°C до тех пор, пока макрофаги не начнут сокультураться.
2. Совместное культивирование первичных перитонеальных макрофагов на вставке для клеточной культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите сокультуры через 4 часа после первоначального покрытия диссоциированных нейронов DRG
- Первичные перитонеальные макрофаги получают из взрослых самцов мышей C57BL6 в возрасте от 8 до 12 недель. Усыпьте животное в камере с СО2. Аккуратно надрежьте кожу живота, обнажите брюшину и избегайте разреза брюшины, чтобы предотвратить утечку жидкости для промывания.
- Проколите брюшину с помощью шприца с иглой 22G и введите в брюшную полость 10 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS). Аккуратно массируйте брюшину в течение 1-2 минут. Затем вытащите иглу и выдавите PBS через место прокола иглы, а жидкость для промывания соберите в коническую пробирку объемом 50 мл.
заметка: Перед использованием поставьте шприц на лед, чтобы сохранить холодность ПБС.
- Центрифугируйте жидкость для промывания при 239 x g в течение 10 минут при 4 °C для гранулирования клеточных компонентов. Суспендировать гранулу с 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (эритроцитов) в течение 3 минут при комнатной температуре. Затем снова центрифугируйте клеточную суспензию при 239 x g в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулу 3 мл PBS и снова центрифугируйте клеточную суспензию><, чтобы удалить любой оставшийся буфер для лизиса эритроцитов.
заметка: Убедитесь, что буфер для лизиса эритроцитов полностью удален. В противном случае оставшийся буфер для лизиса эритроцитов может быть токсичным для культивируемых макрофагов.
- Ресуспендируйте гранулированные клетки в 1 мл нейробазальной/B-27 среды. Пластину половины всех собранных макрофагов (всего от 3 × 106 до 6 х 106 клеток) на клеточную культуральную вставку с эффективной площадью 4,2см2, которую помещают сверху лунки диссоциированных DRG.
заметка: В период совместного культивирования макрофаги выращивают в культуральной среде нейробазала/нейронов B-27. Подтверждена адекватная выживаемость макрофагов в этом состоянии.
3. Лечение db-cAMP (дибутирилциклический АМФ) и сбор макрофагов CM
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните лечение db-cAMP через 4 часа после совместного культивирования нейронов и макрофагов.
- Добавьте 2 мкл 100 мкМ раствора db-cAMP к культурам нейронов и макрофагов. Добавьте тот же объем PBS для контрольного эксперимента.
- Через 24 ч заполните пустую лунку 1 мл питательной среды для макрофагов в том же 6-луночном планшете. Перенесите вставку с клеточной культурой в кокультурах нейрон-макрофаг в пустую лунку с помощью среды для культивирования макрофагов. Держите клетки в одних и тех же условиях в течение 72 часов, не меняя среду.
заметка: Во время сбора КМ мы добавляем всего 1 мл питательной среды для макрофагов для получения концентрированного КМ. Во время сбора КМ, при необходимости, мы добавляли больше, чтобы полностью покрыть макрофаги внутри вставки.
- Через 72 ч центрифугируйте макрофаг CM при 239 x g в течение 5 мин для удаления клеточных компонентов. Пропустите надосадочную жидкость через фильтр размером 0,2 мкм, чтобы удалить оставшийся клеточный мусор. Храните собранный СМ при температуре -70 °C до использования.