Использование кондиционированной макрофагальной среды для стимулирования удлинения нейронов

Аннотация

Источник: Yun, H. J., et al. Нейрон-макрофагальные культуры для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с активностью роста нейритов. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует анализ для стимулирования роста проекций нейронов, известных как рост нейритов, с использованием среды, кондиционированной макрофагами. Совместно культивируйте нейроны и макрофаги с цАМФ и собирайте кондиционированную среду, полученную из макрофагов. Выращивание нейронов кондиционированной средой способствует вырастанию нейритов. Эти выросты флуоресцентно помечены и визуализированы с помощью флуоресцентного микроскопа.

Протокол

1. Обработка db-camp и сбор кондиционированной среды с макрофагами

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните лечение db-cAMP через 4 часа после совместного культивирования нейронов и макрофагов.

1. Добавьте 2 мкл 100 мкМ раствора дибутирилциклического АМФ (db-cAMP) к сокультурам нейронов и макрофагов. Добавьте тот же объем фосфатно-буферного салина (PBS) для контрольного эксперимента.
2. Через 24 ч заполните пустую лунку 1 мл питательной среды для макрофагов в том же 6-луночном планшете. Перенесите вставку из клеточной культуры в кокультурах нейрон-макрофаг в пустую лунку с питательной средой для макрофагов. Держите клетки в одних и тех же условиях в течение 72 ч, не меняя среду.
   заметка: Мы добавляем всего 1 мл питательной среды макрофагов во время сбора кондиционированной среды (КМ) для получения концентрированной КМ. Во время сбора КМ, при необходимости, мы добавляли больше, чтобы полностью покрыть макрофаги внутри вставки.
3. Через 72 ч центрифугируйте макрофаг CM при 239 x g в течение 5 мин для удаления клеточных компонентов. Пропустите надосадочную жидкость через фильтр размером 0,2 мкм, чтобы удалить оставшийся клеточный мусор. Храните собранный СМ при температуре -70 °C до использования.

2. Анализ нейритовых наростов с собранным КМ

1. Перед установкой отдельной культуры нейронов DRG у взрослых предварительно покройте предметное стекло 8-луночной камеры поли-D-лизином и ламинином. Инкубируйте 6-луночный планшет с 0,01% поли-D-лизина при 37°C в течение 2 ч или при 4°C в течение ночи. Затем дважды промойте тарелку дистиллированной водой.
2. Инкубировать пластину с раствором ламинина в концентрации 3 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем дважды промыть пластину дистиллированной водой. Сушите тарелку при комнатной температуре не менее 1 часа.
3. Получить диссоциированные взрослые нейроны DRG в нейробазальной среде с добавлением B27. Планшет 5 x 10^{по 4} ячейки на лунку на предварительно покрытое 8-луночное камерное скольжение.
4. Поместите предметное стекло камеры в инкубатор с температурой 37 °C на 2 часа, позволив ячейкам прикрепиться к дну. Затем замените питательную среду размороженной КМ, предварительно нагретой до 37 °C.<бр/> заметка: Будьте осторожны, чтобы не касаться дна предметного стекла 8-луночной камеры при извлечении питательной среды и добавлении собранного КМ.
5. Через 15 ч после первоначального покрытия удалите среду и промойте ячейки PBS один раз. Затем добавьте в лунки 200 μL ледяного 4% раствора параформальдегида и инкубируйте клетки с раствором параформальдегида в течение 20 минут при 4 °C
   заметка: Культура нейронов DRG для анализа роста нейритов должна быть точно ограничена 15 ч. При этом условии заметного вырастания нейритов не наблюдается.
6. Трижды промыть ледяным PBS, а затем провести блокирование 10% нормальной козьей сывороткой (NGS) с 0,1% Triton-X в течение 30 мин. Инкубировать фиксированные клетки с раствором первичного антитела (anti-Tuj-1), разведенным 10% NGS (в концентрации 1 мкг/мл) в течение 4 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
7. Трижды промыть PBS, а затем инкубировать клетки раствором вторичного антитела (козы-антимыши) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем дважды промойте PBS и закрепите предметное стекло с покровным стеклом (24 × 50 мм) с помощью монтажного раствора.
8. Сделайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы визуализировать нарост нейритов (рис. 1).

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные результаты анализа роста нейритов с использованием кондиционированной среды, полученной из различных условий. (А, Б) Взрослые нейроны DRG были остро диссоциированы и культивировались в течение ровно 15 ч. Через 2 ч после осаждения культуральная среда была заменена кондиционированной средой (КМ), полученной из сокультур нейронов и макрофагов, обработанных либо PBS (A), либо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вставка для клеточных культур прозрачная ПЭТ-мембрана с размером пор 0,4 мкм	Корнинг, Сокол	353090 (Английский	Прозрачная ПЭТ-мембрана с размером пор 0,4 мкм, для 6-луночного планшета
Нейлоновое сетчатое фильтр 70 мкм	Корнинг, Фалькон	No 352350 (Английский
8-луночный предметный стекл для культуры	Биокоут	354632	с равномерным нанесением поли-D-лизина
Нейробазальная среда	Thermo Fisher Scientific, Gibco	No 21103-049	Содержит 1% глутамакса и 1% пеницилина-стрептомицина
Добавка B-27, без сыворотки	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	внеклеточное решение
Глутамакс	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061 (Английский)
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Гидробромид поли-D-лизина	Сигма-Олдрич	П6407-5МГ
Ламинин	Thermo Fisher Scientific, Инвитроген	No 23017-015
Аденозин 3', 5'-циклический монофосфат, N6,O2'-дибутирил-, натриевая соль	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	No 28745
10% Обычная козья сыворотка	Thermo Fisher Scientific	16210072
Тритон-Х-100	Тэчжун Кемикал энд Метал Ко	8566-4405 (Английский)
Анти β III тубулин (Tuj-1)	Корпорация Promega	Г7121	Мышиное моноклональное антитело
Козье вторичное антитело к мышиному IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Инвитроген	А11005
Гемацитометр	Мариенфельд-Супериор	Н/Д
Инкубатор для клеточных культур CO2	Панасоник	Н/Д
Настольная центрифуга	Сорвалл	Н/Д
Конфокальный микроскоп	Олимп Америка Инк	IX71
FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота)	VWR International, Hyclone	SH30919.03