Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Микрофлюидная камера или подготовка MFC
- Литье PDMS в первичные формы (Рисунок 1)
- Приобретите или создайте первичные формы (пластины) в соответствии с подробным протоколом.
- Используйте сжатый воздух для удаления любых загрязнений с вафельной платформы, прежде чем приступать к этапу нанесения покрытия. Поверхность пластин должна выглядеть гладкой и четкой.
- Наполните емкость 50 мл жидкого азота. Подготовьте шприц объемом 10 мл и иглу 23 г.
заметка: Все процедуры, начиная с этого шага вперед, необходимо выполнять в химическом вытяжке.
- В химический колпак с помощью шприца и иглы наберите 2 мл жидкого азота. Хотя может показаться, что воздух был втянут, шприц наполнен азотом (Рисунок 1А). Поместите пластину, содержащую пластину, в герметичный контейнер.
- Откройте флакон с хлортриметилсиланом, проткните резиновый колпачок с помощью шприца, наполненного азотом, и введите все содержимое шприца во флакон. Не вытаскивая иглу, переверните флакон вверх дном и наберите обратно 2 мл хлортриметилсилана.
заметка: Из-за давления шприца небольшое количество хлортриметилсилана распыляется из иглы. Чтобы избежать опасности, направьте иглу к внутренней стенке капюшона (рисунок 1B).
- Равномерно распределите хлортриметилсилан в контейнере (с шага 1.1.4), но не непосредственно на пластину или пластиносодержащую пластину. Закройте контейнер и выдерживайте в течение 5 минут на каждую.
заметка: Если пластина впервые покрывается хлортриметилсиланом, то для каждой пластины следует провести инкубацию в течение 1 часа.
- Не вынимайте пластины и контейнер из вытяжки для химикатов в течение 30 мин.<бр/>
осторожность: Хлортриметилсилан обладает высокой летучей летучей способностью.
- Взвесьте основание PDMS (см. Таблицу материалов) в пробирке объемом 50 мл и добавьте отвердитель PDMS в соотношении 16:1 соответственно (например, 47,05 г основания и 2,95 г отвердителя). Перемешивайте в течение 10 минут с помощью низкоскоростного ротатора.
- Залейте PDMS в каждую пластину, содержащую пластины, до желаемой высоты (рис. 1C).
заметка: Использование тонких микрофлюидных камер (до 3-4 мм) улучшает прилегание к чашке для культуры и предотвращает утечку.
- Поместите все пластины вместе в вакуумный эксикатор на 2 часа (Рисунок 1E). Этот процесс удаляет воздух, попавший в PDMS, тем самым устраняя пузырьки воздуха и образуя четкую, однородную форму.
- Поместите тарелки в духовку на 3 часа (или на ночь) при температуре 70 °C (рис. 1E).
заметка: Пластины должны быть ровными при помещении в духовку.
- Литье PDMS в эпоксидные формы
заметка: Поскольку подготовка пластин является дорогостоящей, требует специального оборудования и может повредить хрупкие пластины, можно создать эпоксидные копии пластин. Реплики дешевле, долговечнее и могут использоваться для массового производства микрофлюидных камер.
- Литье и отверждение PDMS (как описано в пунктах 1.1.8-1.1.11) в исходную пластину.
- Удалите и отрежьте лишние части PDMS, оставив только микрофлюидные элементы и функциональную область, необходимую для их переработки в микрофлюидные камеры.
- Немедленно обмотайте PDMS плотной липкой лентой, чтобы предотвратить накопление пыли.
- Выберите пластиковую чашку для культуры тканей, которая вмещает всю PDMS внутри, и оставьте место для эпоксидной смолы вокруг нее. Расстояние от PDMS до пластиковой тарелки должно быть менее 5 мм.
- Приготовьте небольшое количество PDMS, смешанного в соотношении 10:1 (основание: отвердитель). Свежая жидкость PDMS будет использоваться для приклеивания твердого PDMS к нижней части пластиковой пластины.
- Нанесите минимальное количество жидкости PDMS на центральное дно пластиковой пластины, а затем снимите липкую ленту с PDMS и приклейте ее к дну пластиковой посуды. Убедитесь, что микрофлюидные элементы направлены вверх.
- Дайте PDMS затвердеть в течение 30 минут в духовке при температуре 70 °C.
- Приготовьте эпоксидную смолу, смешав основу и отвердитель в пропорции 100:45 соответственно в пробирке. Различные эпоксидные смолы могут иметь разные пропорции смешивания. Необходимый объем для обычной пластины 100 мм составляет примерно 40 мл.
- Дайте эпоксидной смоле хорошо перемешаться в течение 10 минут во вращателе, пока смесь не станет заметно однородной (т.е. в жидкости не будет видимых артефактов, похожих на волокна).
- Центрифугируйте эпоксидную смесь при давлении 400 x g в течение 5 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха, попавшие внутрь.
- Во время центрифугирования нанесите тонкий слой силиконовой смазки вокруг стенок и всех других открытых пластиковых частей чашки для культуры. Это предотвратит полимеризацию эпоксидной смолы вместе с пластиком посуды и позволит легко удалить отвержденную эпоксидную смолу в конце протокола.
- Медленно насыпьте эпоксидную смолу в посуду до тех пор, пока она полностью не покроет PDMS и не выйдет за ее пределы не менее чем на 5 мм. Не допускайте образования пузырьков внутри эпоксидной смолы, соблюдая нулевое расстояние между трубкой и тарелкой. Поместите пластину в надежное место, чтобы она не перемещалась в течение следующих 48 часов.
- Через 48 часов эпоксидная смола должна полностью отверститься. Вставьте пластину в разогретую до 80 °C духовку на 3 часа для окончательного отверждения.
- Удалите отвержденную эпоксидную смолу с пластины и оригинальной формы PDMS, осторожно потянув за пластиковую стенку пластины до тех пор, пока она не сломается. Затем он должен легко отделиться от эпоксидной смолы и отклеиться.
- После извлечения сотрите остатки жира с новой эпоксидной реплики и установите ее вверх ногами (т.е. реплицированными микрофлюидными элементами вверх) в новую чашку для культуры. Эпоксидная копия теперь готова к литью PDMS.
- Используйте сжатый воздух или N2, чтобы сдуть остатки PDMS или грязь с эпоксидной формы и промойте ее 2 раза изопропанолом. Наполните его в третий раз и выдержите в течение 10 минут на орбитальной вибростенде. Еще раз промойте форму 3 раза изопропанолом и слейте оставшуюся жидкость. Высушите феном с помощью воздуха или N2 или поместите в духовку при температуре 70 °C до полного высыхания.
заметка: Соблюдайте правила безопасности при работе с изопропанолом и отказе от него.
- Держите формовочные пластины закрытыми до начала литья. Выполните шаги 1.1.8.-1.1.11.
- Пробивка и формовка PDMS в MFC (Рисунок 2)
- Разрежьте и снимите форму PDMS с пластины, следуя отметкам (+) на пластинах с помощью скальпеля. Не применяйте силу, так как формы хрупкие (Рисунок 2A).
- Следуйте инструкциям, нарисованным на эскизе, чтобы пробить и вырезать камеры в зависимости от экспериментальной установки (Рисунок 2B-F).
- Для культуры эксплантов спинного мозга (рис. 2C, E) проделайте две лунки по 7 мм в дистальной части большой MFC. Расположите колодцы таким образом, чтобы они перекрывались с краями канала. На проксимальной стороне пробейте одну лунку диаметром 7 мм в середине канала, с минимальным перекрытием, чтобы оставить достаточно места для эксплантов. Проделайте еще два отверстия по 1 мм по двум краям проксимального канала. Поверните MFC микрофлюидными элементами вверх и с помощью иглы 20 G вырежьте три небольшие углубления экспланта на пробитом 7 мм углублении.
- Для диссоциированной культуры МН (рис. 2D, F) пробейте четыре лунки по 6 мм по краям двух каналов небольшого МФЦ.
- Стерилизация MFC для использования в культуре тканей
- Расстелите на скамейке ленты длиной 50 см. Нажмите и оттяните камеру назад, чтобы она была обращена к липкой ленте (как верхней, так и нижней) и удалите сырую грязь. Поместите чистые камеры в новую пластину диаметром 15 см. < />
заметка: Не нажимайте непосредственно на микрофлюидные элементы, когда они обращены вверх.
- Инкубируйте камеры в аналитическом 70% этаноле в течение 10 мин на орбитальном шейкере.
- Утилизируйте этанол и высушите камеры в шкафу для культуры тканей или в духовке при температуре 70 °C.
- Размещение MFC на тарелке со стеклянным дном
- Поместите камеру в центр чашки со стеклянным дном класса культуры тканей 35 мм/50 мм и приложите небольшое усилие к краям, чтобы сделать PDMS и дно чашки связанными. Чтобы не сломать стеклянное дно, всегда прикладывайте усилие к поверхности твердого тела.
- Выдерживать в течение 10 минут при температуре 70 °C. Нажмите на камеры, чтобы усилить прилегание к пластине.
- Инкубировать под ультрафиолетовым светом в течение 10 минут.
- Нанесение покрытий и культивирование
- Добавьте 1,5 нг/мл поли-L-орнитина (PLO) в оба отсека. Убедитесь, что PLO проходит через каналы, несколько раз пипетируя материал для покрытия непосредственно на входе в канал.
- Рассмотрите микрофлюидную камеру под световым микроскопом с 10-кратным увеличением, чтобы проверить наличие пузырьков воздуха. Если пузырьки воздуха блокируют микроканавки, поместите MFC в вакуумный эксикатор на 2 минуты. Позже удалите лишний воздух, попавший в каналы, путем дозирования фильтрующего материала для покрытия через них. Высиживайте в течение ночи.
- Замените PLO на ламинин (3 мкг/мл в DDW) для ночной инкубации таким же образом.
- Перед нанесением покрытия промойте ламинин питательной средой для нейронов.
2. Покрытие культуры нейронов
- Культура эксплантатов спинного мозга
- С помощью прямых ножниц и тонких щипцов препарируйте спинной мозг из эмбриона мыши E12.5 ICR-HB9:GFP. Работайте в растворе 1X HBSS с 1% пенициллин-стрептомицином (P/S) (рисунок 3A-C).
- С помощью ножниц для микродиссекции удалите мозговые оболочки и тыльные рога (рисунок 3D).
- Разрежьте спинной мозг на поперечные срезы толщиной 1 мм (рисунок 3E). Утилизируйте всю среду из проксимального отсека MFC.
- Возьмите один эксплант спинного мозга с помощью пипетки общим объемом 4 мкл. Введите эксплант как можно ближе к пещере и вытяните излишки жидкости из проксимальной лунки через боковые отверстия (1 мм прокола). Экспланты должны быть отсасываются в проксимальный канал.
- Медленно добавьте 150 мкл эксплантной среды спинного мозга (SCEX, см. Таблицу материалов и Таблицу 3) в проксимальную лунку.
- Поддержание культуры эксплантации спинного мозга
- Добавьте среду SCEX в проксимальный отдел и богатую среду SCEX (SCEX с 50 нг/мл BDNF и GDNF) в дистальный отдел. Поддерживайте объемный градиент не менее 15 мкл на лунку между дистальными лунками (больший объем) и проксимальной лункой.
- Обновляйте средство каждые 2 дня. Для дистального пересечения аксонов может потребоваться до 3-5 дней.
3. Аксональный транспорт (Рисунок 4A)
- Маркировка митохондрий и кислотных компартментов
- Приготовьте свежую среду SCEX (или ЧНБ для диссоциированной МН), содержащую 100 нМ Mitotracker Deep Red FM и 100 нМ LysoTracker Red. Выдерживать 30-60 минут при температуре 37 °C. Можно использовать и другие цвета, если их флуорофоры не перекрываются.
- Умойте 3 раза теплой средой CNB/SCEX. Пластины готовы к визуализации.
- Визуализация в реальном времени
- Получение 100 серий покадровых изображений аксонального транспорта с интервалом 3 с, всего 5 минут на фильм.
заметка: Система визуализации, использованная в этом исследовании, включала в себя инвертированный микроскоп, оснащенный вращающимся диском конфокала, управляемый с помощью собственного программного обеспечения для визуализации клеток, 60-кратную масляную линзу, NA = 1,4 и камеру EMCCD. Фильмы приобретались в контролируемой среде при температуре 37 °C и 5% CO2,
заметка: В зависимости от эксперимента можно создавать более длинные или короткие интервальные видеоролики. При необходимости можно записать даже ночные фильмы. Тем не менее, крайне важно попытаться уменьшить время экспозиции и мощность лазера, а также общее количество изображений, чтобы уменьшить фототоксичность и обесцвечивание во время съемки видео.
