Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка материалов
- Перед проведением эксперимента стерилизуйте все инструменты и ddH2O с помощью автоклава. Инструменты включают, помимо прочего, хирургические ножницы, офтальмологические ножницы, щипцы, ложки-делители ядра, стеклянную посуду (диаметр 60–100 мм) и стеклянные стаканы.
- Приготовьте раствор Кребса (Таблица 1): Растворите все химические вещества с ddH2O перед использованием. Растворите CaCI2 отдельно и медленно добавляйте в смешанный раствор, помешивая, чтобы избежать осадка.
- Приготовьте среду для полоскания, которая состоит из среды F12 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотиком/антимикотическим средством (100x). Добавьте 5 мл FBS и 0,5 мл антибиотика/антимикотика к 44,5 мл среды F12.
- Приготовьте нейронную среду А, которая включает нейробазальную среду А с 2% B-27, 1% FBS, 1% L-глутамина, 1% антибиотика/антимикотика (100x) и 0,1% нейротрофического фактора, полученного из глии (GDNF). Добавьте 200 мкл B-27, 100 мкл FBS, 100 мкл L-глутамина, 100 мкл антибиотика/антимикотика (100x) и 10 мкл GDNF (10 мкг/мл) к 9,5 мл нейробазальной среды А.
заметка: Приготовьте нейронную среду А в течение одной недели после использования, чтобы обеспечить свежесть B-27, L-глутамина и GDNF.
- Получают нейронную среду В, используя ту же процедуру, что и получение нейронной среды А, но без добавления FBS.
- Приготовьте раствор для дигезирования 1, растворив 20 мг коллагеназы типа II, 6 мг бычьего сывороточного альбумина и 200 мкл антибиотика/антимикотика (100x) в 10 мл кислородно-стабильного раствора Кребса.
- Приготовьте раствор для дигезирования 2, разбавив 1 мл 0,25% трипсина с 4 мл сбалансированного раствора соли Хэнка.
- Подготовьте тарелку с покрытием.
- Используйте щипцы на стенде с ламинарным потоком при помещении стеклянных покровных стекол в 48-луночный планшет для культивирования.
- Разбавляют поли-D-лизин ddH2O до концентрации 0,1 мг/мл в виде поли-D-лизина. Хранить бульон при температуре –20 °C, перед тем как разморозить
- Добавьте 40 мкл поли-D-лизина на верхнюю часть каждого покровного стекла и инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 10 мин.<бр/>
заметка: Отрегулируйте концентрацию до 4 мкг/см2 для разных пластин с разными базальными площадями. Например, если базальная площадь одной лунки из 24-луночного планшета составляет 2см2, то мы должны перенести в лунку 80 мкл поли-D-лизина. Каждыйсм2 будет содержать 4 мкг поли-D-лизина.
- Удалите поли-D-лизин из 48-луночного планшета и трижды промойте покровные стекла ddH2O.
- Высушите пластину в колпаке с ламинарным потоком не менее 30 минут, чтобы убедиться, что пластина безводна.
- Храните пластину при температуре 4 °C перед нанесением ламинина не более 1 суток. Хранение тарелки при температуре −20 °C предпочтительно при длительном хранении.
- Разморозьте ламинин при 4 °C. Разбавьте ламинин ddH2O до концентрации 50 мкг/мл в виде запаса ламинина. Храните бульон при температуре –20 °C и размораживайте при 4 °C перед использованием.
- С помощью пипетки перенесите 100 мкл разбавленного ламинина в верхнюю часть каждого покровного стекла и инкубируйте ламинин при 4 °C в течение 1 ч.<бр/>
заметка: Отрегулируйте концентрацию до 5 мкг/см2 для разных пластин с разной базальной площадью. Например, если базальная площадь одной лунки из 24-луночного планшета составляет 2 см2 , то перенесите в лунку 200 мкл разведенного ламинина. Каждыйсм2 будет содержать 5 мкг ламинина.
- Удалите раствор ламинина и промойте покровные стекла ddH2O один раз. Выполняйте эту операцию на краю покровного стекла, чтобы избежать соскабливания.
заметка: Покровные стекла с покрытием можно хранить при температуре 4 °C не более 2 недель.
2. Сбор урожая мочевого пузыря
- Приобретите пятинедельных крыс породы Спрэг-Доули.
- Вмешайте карбоген (95% кислорода, 5% CO2) в раствор Krebs в течение не менее 30 минут на ледяной бане до достижения стабильного уровня кислорода и pH.
- После эвтаназии через вывих шейки матки замочите крыс в 75% этаноле на 30 секунд для стерилизации.
- Поместите крыс на стерилизованное хирургическое полотенце и обнажите их брюшную полость. Вскройте брюшную полость и обнажите мочевой пузырь с помощью набора ножниц и щипцов.
- Осторожно поднимите мочевой пузырь и отрежьте мочевой пузырь от шейки мочевого пузыря с помощью другого набора ножниц и щипцов, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Быстро поместите мочевой пузырь в холодный, устойчивый к кислороду раствор Кребса для повышения выживаемости клеток.
заметка: После удаления мочевого пузыря быстро выполните следующие операции, чтобы улучшить перспективы выживания нейронов.
- Добавьте раствор Кребса в три стеклянные посуды и стеклянные стаканы.
- Приготовьте стеклянную посуду и стаканы с раствором Кребса на ледяной бане для предварительного охлаждения.
- Отметьте эти контейнеры цифрами от 1 до 3 соответственно, чтобы избежать путаницы.
- Соедините каждую стеклянную тарелку с щипцами и ложкой делителя ядра.
- В стеклянной посуде 1 разрежьте мочевой пузырь офтальмологическими ножницами и разверните его с помощью щипцов и ложек делителя ядра.
- Промойте мочевой пузырь в стеклянном стакане 1 и поместите его в стеклянную посуду 2.
- Устранить адгезивный жир на поверхности тканей с помощью щипцов и офтальмологических ножниц в стеклянной посуде 2.
- Промойте мочевой пузырь в стеклянном стакане 2 и поместите его в стеклянную посуду 3.
- Аккуратно соскребите мочевой пузырь с помощью щипцов и ложек разделителя ядер на стеклянную чашку 3, чтобы удалить экзогенные прикрепления.
- Промойте мочевой пузырь в стеклянном стакане 3, переложите мочевой пузырь в центрифужную пробирку объемом 15 мл с 14 мл холодного раствора Кребса и вращайте образец в течение 1 минуты при 356 x g и 4 °C.
- Повторите предыдущий шаг дважды в двух других пробирках с раствором Кребса, чтобы уменьшить загрязнение.
3. Двухступенчатое переваривание мочевого пузыря
- Переложите мочевой пузырь из центрифужной пробирки во флакон объемом 2 мл, содержащий 1 мл раствора для сбраживания 1. С помощью офтальмологических ножниц разрежьте мочевой пузырь на небольшие кусочки (меньше 1 мм) в растворе.
- Смешайте раствор мочевого пузыря с 9 мл раствора для пищеварения 1 в стерильной чашке для клеточных культур (диаметр 100 мм). Выполните этап 1 разложения в встряхивающем инкубаторе в течение 1 часа при 5% CO2, 37 °C и 200 об/мин.
- После этапа 1 разложения центрифугируйте раствор при 356 x g при 4 °C в течение 8 минут.
- Поместите раствор для сбраживания 2 в водяную баню при температуре 37 °C для предварительного нагрева.
- После центрифугирования удаляют надосадочную жидкость, содержащую раствор для разложения 1, и собирают осадок клеток. Допускается некоторое количество оставшейся жидкости. Полное удаление раствора может способствовать потере клеток.
- Смешайте осадок клетки с теплым раствором для сбраживания 2 в центрифужной пробирке объемом 15 мл и встряхните смесь во время разложения на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут. Не превышайте 7 минут на этапе 2 пищеварения, иначе нейроны погибнут.
- После разложения немедленно деактивировать трипсин в смеси с помощью 10 мл холодного промывочного средства.
заметка: Выполните следующие действия при температуре от 0 °C до 4 °C. Ледяная ванна могла бы обеспечить такие условия.
- Соберите клеточный осадок после центрифугирования при температуре 356 x g при 4 °C в течение 8 мин. Удалите как можно больше среды, так как оставшийся трипсин вредит росту клеток.
- Осторожно суспендируйте осадок с помощью 3 мл нейронной среды. Следите за тем, чтобы в растворе, содержащем клетки, не образовывались пузырьки воздуха для обеспечения высокой выживаемости.
- Отфильтруйте смесь через сетчатый фильтр 70 μм в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Держите фильтрат на шейкере при 30 об/мин на ледяной бане в течение 30 минут. Этот шаг не обязателен, но рекомендуется.
- Соберите клетки центрифугированием при 356 x g при 4 °C в течение 8 мин и осторожно ресуспендируйте клеточные гранулы в 1 мл нейронной среды А.
- Добавьте по 500 мкл клеточной смеси в каждую лунку подготовленного 48-луночного планшета.
- Культивирование клеток в инкубаторе при 37 °C и 5%CO2.
- Замените все среды нейронной средой B через 1 ч, чтобы обеспечить бессывороточную культуру.
- Меняйте половину нейронной среды B каждые 3 дня.
заметка: Нейроны готовы к иммуноцитохимическим экспериментам через 5–7 дней культивирования.
Таблица 1. Состав раствора Кребса
См.
См.
См.
См.
| Ингредиенты | Молярность (мМ) |
| НаКИ | 120 |
| ККИ | 5,9 |
| НаОГС3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| глюкоза | 11.5 |
