$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка и нанесение покрытий на многокамерные чипы
- Поместите чип в биозащитный шкаф в чашку Петри или другой подходящий стерильный контейнер.
- Добавьте 100 μL раствора для предварительного нанесения покрытия в верхнюю левую лунку чипа и дайте ему течь по основному каналу в соседнюю лунку.
заметка: Решение для предварительного нанесения покрытия используется для предварительного покрытия микрофлюидных каналов, чтобы исключить возможность улавливания пузырьков воздуха внутри чипа.
- Заполните левую нижнюю лунку 100 μл раствора для предварительного покрытия. Подождите 5 минут, чтобы раствор протек через микробороздки.
- Добавьте 100 μL раствора предварительного покрытия в верхнюю правую лунку и дайте ему течь по основному каналу в соседнюю лунку. Заполните правую нижнюю лунку 100 μл раствора для предварительного нанесения покрытия.
- Отсасывайте раствор из каждой лунки. Отсасывайте от основных каналов, чтобы избежать удаления жидкости из основных каналов (Рисунок 1A). Немедленно добавьте 150 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) в верхнюю левую лунку. Подождите 1,5 мин.
осторожность: Не отсасывайте всю жидкость из закрытых основных каналов.
- Добавьте 150 μL PBS в левую нижнюю лунку. Подождите 5 минут, чтобы жидкость протекла через микроканавки. Добавьте 150 μL PBS в верхнюю правую лунку. Добавьте 150 μL PBS в нижнюю правую лунку. Подождите 10 минут.
- Повторите шаги 1.5-1.6 для второй стирки PBS.
- Проверьте чип под микроскопом тканевой культуры на наличие пузырьков в основных каналах. Если пузырьки присутствуют, выполните следующие процедуры. Если пузырьков нет, перейдите к шагу 1.9.
- Отсасывайте PBS из лунок, наклоняя кончик пипетки в сторону от отверстия канала (Рисунок 1A).
- Налейте 100 мкл раствора для предварительного нанесения покрытия в верхнюю лунку, наклоняя кончик пипетки к отверстию канала (рис. 1B). Пузыри должны переместиться по каналу в нижнюю лунку. Подождите 1,5 минуты.
- Повторите шаги 1.3-1.8.
- Отсасывайте PBS из лунок, наклоняя кончик пипетки в сторону от отверстия канала (Рисунок 1A).
- Добавьте 100 мкл 0,5 мг/мл поли-d-лизина (PDL) в верхнюю левую лунку чипа. Подождите 1,5 минуты. Заполните нижний левый колодец 100 μл PDL.
- Добавьте 100 μL PDL в верхнюю правую лунку чипа. Подождите 1,5 минуты. Добавьте 100 μL в правую нижнюю лунку.
- Закройте чашку Петри и поместите чип в инкубатор при температуре 37 °C на 1 час.
- Повторите шаги промывки PBS 1,5-1,6 дважды, чтобы удалить излишки PDL.
- Отсасывайте PBS из устройства.
- Немедленно добавьте 100 мкл среды для клеточных культур в верхнюю левую лунку чипа. Подождите 1,5 минуты. Добавьте медиа в левый нижний колодец. Добавьте медиа в верхнюю правую лунку. Подождите 1,5 минуты. Добавьте 100 мкл среды в нижнюю правую лунку чипа.
- Поместите чип в инкубатор при температуре 37°C до тех пор, пока ячейки не будут готовы к пластинированию.
2. Засеивание нейронов в многокамерные чипы
- Получить клеточную суспензию диссоциированных нейронов гиппокампа крысы в соответствии с установленными протоколами для получения плотности ~12 × 106 клеток/мл.<бр/>
заметка: Возможно использование суспензий клеток с плотностями от 3 до 12 × 10до 6 клеток/мл. Если используется более низкая плотность, объем суспензии ячеек, добавляемой в чип, может быть увеличен. Описанная ниже процедура применима к диссоциированным корковым нейронам или нейронам гиппокампа мышей. Оптимальная плотность клеток для других типов нейронов может варьироваться.
- Удалите большую часть среды из каждой лунки чипа, оставив в каждой лунке примерно 5 μл. Отсасывайте от основных каналов, чтобы избежать удаления жидкости из основных каналов (рис. 1A).
осторожность: Не отсасывайте жидкость из закрытых основных каналов. Пузырьки воздуха могут застрять в чипе, если жидкость всасывается из основных каналов.
- Загрузите 5 мкл клеточной суспензии в верхнюю правую лунку и еще 5 мкл клеточной суспензии в нижнюю правую лунку (всего ~120 000 ячеек). Загрузите ячейки, расположив их рядом с основным каналом (рис. 1B). Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что нейроны находятся в основном канале. Подождите 5 минут, чтобы ячейки прикрепились.
заметка: Нейроны могут быть загружены в любой отсек. Для пояснения, соматический компартмент является основным каналом с правой стороны, но любой компартмент может быть использован в качестве соматического компартмента. Возможно использование ячеек с более низкой плотностью до 60 000 ячеек на чип. До 10 мкл клеточной суспензии может быть добавлено в каждую лунку соматического компартмента в сочетании с клеточной суспензией с меньшим количеством клеток, чем описано выше.
- Добавьте приблизительно 150 мкл питательной среды нейронов в каждую из верхних и нижних правых лунок, а затем добавьте по 150 мкл среды в каждую верхнюю и нижнюю левую лунку. Поместите чип в увлажненный лоток в инкубатор с 5%CO2 37 °C.
- Через 24 ч выполните замену среды, удалив среду из лунок. Убедитесь, что основной канал остается заполненным. Добавьте по 150 мкл среды в каждую верхнюю лунку, затем заполните нижние лунки.
- Поместите чип обратно в инкубатор на желаемое количество дней.
заметка: Следите за тем, чтобы носитель оставался светло-розовым. Если среда желтоватая, замените 50% ее свежей средой. Если уровень жидкости низкий, обеспечьте достаточную влажность и соответствующую вторичную изоляцию стружки для предотвращения испарения. Свести к минимуму или исключить изменения среды можно с помощью вторичной герметизации и/или покрытия чашки, содержащей чип, пленкой политетрафторэтилена (ПТФЭ)-ФЭП.
