Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка растворов для экспериментов
- Приготовьте раствор для покрытия внеклеточного матрикса (ECM) (см. Таблицу материалов): разморозьте смесь ECM на льду. Разведите смесь ECM в соотношении 1:10 в основной питательной среде (без нейротрофических факторов и фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS)) и храните на льду.
- Подготовьте питательную среду (см. Таблицу материалов): Подготовьте запас нейробазальной среды, не содержащей FBS или нейротрофический фактор мозга (BDNF). Добавляйте в нейробазальную среду свежие FBS (10%) и BDNF (5 нг/мл) непосредственно перед добавлением в культуру клеток.
- Приготовьте внеклеточный раствор (см. Таблицу материалов).
2. Промывка и стерилизация МЭА
ПРИМЕЧАНИЕ: MEA, используемые для экспериментов, содержат 68 электродов, расположенных в прямоугольной сетке (Рисунок 1E). Каждый электрод имеет размер 40 х 40мкм2 с расстоянием 200 мкм от центра к центру. Электроды изготовлены из платины. Электроды соединены с соответствующими контактами схемой из оксида индия и олова. Эта схема изолирована слоем SU-8 толщиной 5 мкм. Подробную информацию о поставщике см. в таблице материалов. Для этих экспериментов могут подойти и другие схемы MEA.
- Для новых MEA: Промойте их, погрузив в 70% этанол на 30 секунд и промойте дистиллированной водой в течение 30 секунд. Работайте в колпаке с ламинарным потоком.
- Дайте MEA высохнуть в течение 30 минут в колпаке с ламинарным потоком.
- Поместите каждый MEA в индивидуальную стерильную чашку Петри (35 мм x 10 мм) и запечатайте фольгой. MEA можно хранить до тех пор, пока они не будут использованы.
- Для использованных МЭА: Инкубируйте МЭА в чашке Петри (35 мм x 10 мм), содержащей 1 мл ферментативного раствора (см. Таблицу материалов) O/N на орбитальном вибростенде при РТ для удаления биологического материала. Затем продолжайте, как в шаге 2.1.
заметка: Обращайтесь с MEA осторожно с помощью щипцов с резиновыми наконечниками.
3. Подготовка МПА для экспериментов с культурами
- Снимите уплотнительную пленку и оставьте MEA в чашке Петри (35 мм x 10 мм) на весь эксперимент.
- Нанесите на МЭА раствор, приготовленный в пункте 1.1: С помощью холодного наконечника для дозатора объемом 200 мкл (хранящегося при -20 °C) нанесите 50 мкл раствора покрытия на каждый МЭА, покрывая всю площадь электрода.
- Дайте МЭА нанести слой от 30 минут до 1 часа при RT.
- Удалите раствор покрытия с помощью пипетки. Нанесите 100 мкл питательной среды с добавлением 10% FBS и 5 нг/мл BDNF и оставьте в режиме RT до нанесения покрытия ткани.
- Поместите 2 чашки Петри, содержащие покрытые покрытием МЭА, в большую чашку Петри (94 мм x 16 мм) и добавьте третью маленькую чашку Петри, содержащую 1,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для увлажнения.
заметка: Добавление небольшой чашки Петри (шаг 3.5), содержащей PBS, имеет решающее значение для того, чтобы значительно свести к минимуму испарение питательной среды.
4. Рассечение спирального ганглия
ПРИМЕЧАНИЕ: Грубое рассечение может быть выполнено за пределами колпака ламинарного потока (Шаг с 4.1 по 4.4). Для тонкой диссекции обязательными являются стерильные условия (колпак с ламинарным потоком) (с шага 4.5).
- Усыпляют животных (мышей в возрасте 5-7 дней) путем обезглавливания без предварительной анестезии.
- Стерилизовать голову путем распыления 70% этанола.
- Удерживая голову, разрежьте острыми/острыми ножницами соединение между кожей и черепом по сагиттальной линии.
- Разрежьте череп сагиттально и удалите мозг острыми/тупыми ножницами.
- Отрежьте височные кости от черепа и поместите их в чашку Петри, содержащую стерильный ледяной сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS).
- С помощью диссекционного микроскопа рассеките барабанную перепонку с помощью тонких щипцов и изолируйте внутреннее ухо.
- Удалите кость улитки, используя тонкие щипцы.
- Удалите спиральную связку и сосудистую полоску (СВ) вместе, удерживая щипцами базальную часть спирального ганглия (СГ) и СО и медленно раскручивая СО от основания до верхушки
- Выделите орган Corti (OC), SG и модиолус (рис. 1A-C).
- Отделите ОК от СГ и модиолуса, удерживая щипцами базальную часть СГ и ОК и медленно раскручивая ОК от основания к вершине.
- Вырежьте боковые экспланты (от 200 до 500 мкм в диаметре) из спирального ганглия, все еще прикрепленного к модиолусу (рис. 1D), с помощью щипцов и микроскальпеля.
5. Культура экспланта спирального ганглия на MEA
- Поместите два спиральных ганглионарных экспланта рядом с электродами на МЭА, предварительно приготовленном из 100 мкл питательной среды.
- Поместите кортиевый орган на расстоянии примерно 5 мм от области электрода.
- С помощью щипцов прикрепите экспланты и орган корти к МЭА, избегая при этом повреждения тканей.
- Осторожно поместите МЭА в инкубатор и закваскуйте их при температуре 37 °C и 5%CO2. На следующий день визуально осмотреть, что экспланты прикреплены к MEA.
заметка: Если экспланты не прикреплены к О/Н, они редко будут делать это в течение следующих нескольких дней. ОК размещается рядом с культурой для трофической/нейротрофической поддержки.
- Добавляйте 100 мкл питательной среды, содержащей 10% FBS и BDNF, ежедневно в течение 5 дней подряд.
- На 6-й день добавьте 2 мл питательной среды, содержащей 10% FBS и 5 нг/мл BDNF, и культивируйте ткань в течение еще 13 дней.
