1. Посев астроцитов для перепрограммирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности с уровнем безопасности 1 (SL1).
- Готовьте 24-луночные планшеты со стеклянными покровными стеклами, покрытыми поли-D-лизином, так же, как ранее готовили колбы с культурой. Чтобы определить необходимое количество планшетов, учтите, что астроциты покрываются с плотностью 5-5,5 х 104 клеток на лунку в 24-луночном планшете. Как правило, выделение шести спинных мозгов от мышей на 2-й день после рождения (P2) дает около 1 x 106 клеток.
- Аспиратируйте среду из колб с культурой Т25, содержащих культивируемые астроциты, и промойте один раз 1x фосфатно-солевым буфером (PBS). Отделите астроциты от колбы с культурой, добавив 0,5 мл 0,05% трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. Осторожно постучите по боковой стороне колбы, чтобы освободить клетки от поверхности колбы с культурой, и проверьте отслоение под светлопольным микроскопом с использованием 10-кратного увеличения.
- Прекратить трипсинизацию 2,5 мл питательной среды астроцитов и собрать клеточную суспензию в пробирки объемом 15 мл. Центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин, аспиратировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 1 мл среды для культивирования астроцитов. Рассчитайте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированной системы подсчета клеток.
- Исходя из количества клеток, разбавляют клеточную суспензию свежей средой астроцитов до получения раствора 1-1,1 х 105 клеток на мл. Дополняйте среду эпидермальным фактором роста (EGF) и основным фактором роста фибробластов (bFGF) в концентрации 10 нг/мл на фактор. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии, что эквивалентно 5-5,5 х 104 ячейкам, в каждую лунку ранее приготовленных 24-луночных планшетов и культуральных клеток при 37 °С и 5%СО2.
2. Принудительная экспрессия факторов транскрипции
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к протоколу, важно правильно спланировать эксперимент. В частности, важно всегда включать отрицательный контроль для перепрограммирования, а именно условие, при котором фактор перепрограммирования не выражается. Например, при использовании векторов, несущих кДНК для фактора перепрограммирования и репортера (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), DsRed), отрицательный контроль представлен тем же вектором, несущим только репортер. При выражении нескольких факторов с разными источниками информации, отрицательный контроль должен быть соответствующим образом скорректирован.
- На следующий день после нанесения покрытия осмотрите 24-луночные планшеты, чтобы убедиться, что ячейки прилипли к покровным стеклам.
- Исходя из цели эксперимента и имеющихся ресурсов, принудительная экспрессия факторов перепрограммирования может быть достигнута путем вирусной трансдукции (см. шаг 2.3) или трансфекции ДНК (см. шаг 2.4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ретровируса или лентивируса требует разрешения государственных органов и должно выполняться в шкафу биологической безопасности в лаборатории с уровнем безопасности 2 (SL2).
- Перепрограммируйте астроциты путем трансдукции клеток с помощью ретровируса или лентивируса, несущего генетическую информацию, для экспрессии представляющего интерес фактора (факторов) перепрограммирования, как описано ниже.
- Трансдуцировать клетки с высоким титром вируса 1 x10 10-1 x10 12 частиц/мл путем добавления 1 мкл клеточной суспензии непосредственно в среду астроцитов. Это обеспечивает высокий уровень заражения. Культивируйте клетки с помощью астроцитарной среды, содержащей вирусные частицы, при 37 °C в течение 24-36 ч, прежде чем приступить к разделу 3><, в зависимости от цели эксперимента.
Примечание: Для управления экспрессией трансгенов можно использовать различные промоторы (см. также Репрезентативные результаты). Конститутивные промоторы {например, цитомегаловирус (ЦМВ), куриный β-актин (ЦАГ)} индуцируют экспрессию трансгена раньше, чем индуцируемые промоторы; Тем не менее, оба типа промоторов были успешно использованы для перепрограммирования клеток в нейроны.
- ДНК-плазмиды также могут быть введены в астроциты путем трансфекции ДНК, как описано ниже.
заметка: Это можно сделать в шкафу биологической безопасности, одобренном для SL1.
- Перед трансфекцией необходимо получить реагент для трансфекции, плазмидную ДНК желаемых конструкций, свежую среду астроцитов и среду, восстановленную сывороткой крови (см. Таблицу материалов). Рассчитайте необходимое количество среды, восстановленной в сыворотке (см. Таблицу материалов), учитывая, что для каждой лунки 24-луночного планшета требуется 300 μл среды, восстановленной в сыворотке. Добавьте соответствующее количество среды, протертой в сыворотке, в пробирку объемом 50 мл и нагрейте ее до 37 °C.
- Когда восстановительная среда станет теплой, отсадите астроцитарную среду из всех лунок и соберите ее в пробирку объемом 50 мл. Отфильтруйте собранную астроцитарную среду с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкМ для удаления оторвавшихся клеток.
- Добавьте равный объем свежей астроцитарной среды к отфильтрованной среде до получения раствора, достаточного для добавления 1 мл астроцитарной среды на лунку. Поддерживайте кондиционированную среду астроцитов в инкубаторе при температуре 37 °C до начала использования (шаг 2.4.9).
заметка: Питательная среда используется повторно, так как она содержит несколько секретируемых факторов, которые поддерживают жизнеспособность культуры.
- Добавьте 300 μL предварительно подогретой сыворотки среды в каждую лунку и поместите 24-луночный планшет обратно в инкубатор.
- Приготовьте раствор А, состоящий из ДНК и редуцированной сывороткой среды. Для каждой лунки используйте в общей сложности 0,6 мкг ДНК и добавьте его к 50 мкл среды, восстановленной в сыворотке. Хранить раствор А при комнатной температуре до использования.<бр />
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, учитывается техническая тройка на одно условие. Таким образом, готовят смесь, достаточную для 3,5 реакции (например, 2,1 мкг общей ДНК, разведенной в 175 мкл среды, восстановленной в сыворотке), чтобы обеспечить достаточное количество материала для трансфекции трех лунок 24-луночного планшета.
- Приготовьте раствор В, состоящий из реагента для трансфекции и редуцированной сывороткой среды. Для каждой лунки добавьте 0,75 мкл реагента для трансфекции на 50 мкл среды, восстановленной в сыворотке. Поскольку этот раствор является общим для всех условий трансфекции, приготовьте его в больших количествах, чтобы уменьшить вариабельность при трансфекции.
- Раствор Б инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Раствор Б добавить к раствору А по каплям в соотношении 1:1 и аккуратно перемешать. Не делайте вихрей. Раствор А+В выдерживают в течение 20-30 мин при комнатной температуре под колпаком.
- Повторите шаг 2.4.5-2.4.7 для всех условий трансфекции. Через 20-30 мин добавляйте раствор А+В в каждую лунку по каплям до конечного объема 100 мкл. Осторожно встряхните планшет и поместите клетки обратно в инкубатор при температуре 37 °C на 4 ч.
- Через 4 ч удалите трансфекционную среду и добавьте 1 мл предварительно подогретой астроцитарной кондиционированной среды, приготовленной на шаге 2.4.3. Выдерживайте клетки в течение 36-48 часов, прежде чем приступать к разделу 3, в зависимости от цели эксперимента.
3. Перепрограммирование астроцитов (анализ за 7 дней)
- Приготовьте среду для дифференцировки нейронов, добавив 1 мл добавки B27 к 49 мл основной питательной среды. Через 24-48 ч, в зависимости от того, были ли клетки трансдуцированы или трансфицированы (см. шаги 2.3 и 2.4 соответственно), замените астроцитарную среду 1 мл среды для дифференцировки нейронов на лунку и культивируйте клетки при 37 °C и 9% CO2,
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут содержаться при 5%CO2, если в инкубаторе нет инкубатора с 9%CO2. Однако в этих условиях перепрограммирование нейронов более эффективно.
- Дополнительно: Для повышения эффективности перепрограммирования при замене среды астроцитов на среду для дифференцировки следует добавлять в среду для дифференцировки нейронов форсколин (конечная концентрация 30 мкМ) и дорсоморфин (конечная концентрация 1 мкМ). При выборе лечения клеток Форсколином и Дорсоморфином введите вторую дозу Дорсоморфина через 2 дня после первоначального лечения. Добавьте эту вторую обработку непосредственно в питательную среду.
- Прямое перепрограммирование мышиных астроцитов в нейронные клетки обычно происходит в течение 7 дней после смены среды (рис. 1). Следовательно, через 7 дней после начала перепрограммирования нейронов фиксируйте или собирайте клетки для последующего анализа.
