$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Удаление мозга с неповрежденным корешком слухового нерва для стимуляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши для этих экспериментов были получены путем скрещивания трансгенных мышей ChAT-IRES-Cre на фоне C57BL/6J с мышами-репортерами tdTomato (Ai14). У мышей, используемых для гистологии и электрофизиологии, наблюдалось начало после слуха (P14-P23), что составляет около P12 у мышей. Нейроны, экспрессирующие tdTomato в вентральном ядре трапециевидного тела (VNTB), ранее были охарактеризованы как медиальные оливокохлеарные нейроны (MOC) в этой линии мышей.
- Усыпьте (например, удушитеCO2) и обезглавьте животное с использованием утвержденных институциональных процедур.
- С помощью лезвия бритвы разрежьте кожу по средней линии черепа от носа до задней части шеи. Снимите кожу, чтобы обнажить череп.
- С помощью маленьких ножниц сделайте разрез в черепе по средней линии, начиная от основания (каудального конца возле спинного мозга) черепа и продолжая по направлению к носу.
- На лямбда-шве сделайте надрезы в черепе от средней линии, латерально по направлению к уху с обеих сторон. Снимите череп, чтобы обнажить мозг.
- Начиная с рострального конца, аккуратно приподнимите мозг от черепа с помощью небольшого лабораторного шпателя или тупых щипцов. Перережьте зрительный нерв и продолжайте мягко работать мозгом назад, обнажая вентральную поверхность.
- Перережьте тройничные нервы, пережав их тонкими щипцами у вентральной поверхности ствола мозга.
заметка: Делайте это осторожно, так как вестибулокохлеарный нерв находится чуть ниже этого и должен быть неповрежденным для возможной стимуляции.
- Поместите заготовку в стеклянную чашку Петри, наполненную холодным раствором для нарезки. Поместите чашку под препарирующий микроскоп. Аккуратно пузыритесь с карбогеном.
- Обрежьте лицевой нерв рядом со стволом мозга и обнажите вестибулокохлеарный нерв.
- С помощью тонких щипцов протолкните кончики отверстий, где вестибулокохлеарный нерв выходит из черепа как можно дальше, и зажмите нерв, чтобы разорвать его, оставив нервный корешок прикрепленным к стволу мозга. Повторите это с другой стороны.
- Как только оба нервных корешка освободятся, удалите мозговые оболочки и сосудистую сеть с вентральной поверхности ствола мозга рядом с трапециевидным телом.
- Полностью освободите мозг от черепа, защемив оставшиеся черепные нервы и соединительную ткань, позаботившись о сохранении оставшегося спинного мозга, если это возможно.
2. Блокируйте и монтируйте мозг на сцене (магнитный диск)
- Подготовьте поверхность мозга к фиксации на стадии путем блокировки мозга на уровне зрительного хиазма.
- С помощью тупого инструмента стабилизируйте мозг с помощью тупого инструмента, чтобы аккуратно обездвижить спинной мозг, чтобы мозг не наклонялся во время следующего шага.
- На уровне зрительного хиазма с помощью открытых щипцов создайте плоскость для блокировки мозга путем введения через мозг вниз на дно посуды. Введите щипцы под углом примерно 20° от вертикали так, чтобы кончики выходили из дорсальной поверхности мозга каудально к зрительной хиазме.
- Разрежьте вдоль щипцов с помощью лезвия бритвы.
- Приклейте мозг к поверхности сцены.
- Приготовьте небольшой блок (~1 см3) из 4% агара для поддержки мозга.
- Нанесите небольшую каплю клея на сцену и распределите ее в прямоугольник, чтобы можно было приклеить и мозг, и агаровый блок.
- С помощью щипцов осторожно приподнимите мозг и аккуратно промокните лишнюю жидкость, используя край бумажного полотенца. Поместите заблокированную поверхность на клей, брюшная поверхность будет обращена к лезвию во время нарезки.
- Осторожно прижмите агаровый блок к тыльной поверхности мозга, чтобы поддержать его во время нарезки и обеспечить правильное положение мозга (т.е. под углом).
3. Срез мозга для создания клиновидного слайса
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте срез мозга с помощью вибратома, у которого кохлеарный нерв находится на толстой стороне, а медиальные оливокохлеарные нейроны (MOC) и медиальное ядро трапециевидного тела (MNTB) на тонкой стороне.
- Поместите магнитный диск с прикрепленным мозгом на основание сцены и поместите его в камеру для нарезки так, чтобы вентральная поверхность мозга была направлена в сторону лезвия.
- Заполните камеру ледяным раствором для нарезки и заварите карбогеном.
- Опустите лезвие в раствор и нарежьте ломтики каудально к интересующей области, чтобы убедиться, что ломтики симметричны. Если срезы кажутся асимметричными, слегка наклоните сцену, чтобы получить симметрию.
заметка: Скорость лезвия в диапазоне 0,05-0,10 мм/с была эффективной для резки здоровых ломтиков и может варьироваться в зависимости от возраста животного и области мозга.
- Как только срезы станут симметричными, сдвиньте сцену на ~15° (что соответствует примерно 3 концентрическим кольцам на основании сцены) в одну сторону.
заметка: Сместите сцену в сторону от корешка слухового нерва, который вы хотите сохранить в срезе.
- Продолжайте осторожно резать до тех пор, пока корешок слухового нерва не окажется близко к поверхности с одной стороны, а лицевой нерв не будет виден на поверхности с другой стороны.
- Сдвиньте сценку назад на 15° в исходное положение.
- Отодвиньте лезвие от ткани и поверните основание сцены на 90° так, чтобы боковой край тонкой стороны был обращен к лезвию. Опустите лезвие на несколько сотен микрон, а затем медленно подведите лезвие вплотную к краю ткани. Повторяйте это до тех пор, пока лезвие не коснется бокового края. Опускаем лезвие до нужной толщины тонкого края ломтика, здесь еще двести мкм. <бр/>
заметка: Полученный срез в идеале имеет толщину ~300 мм на уровне вентрального ядра трапециевидного тела (ВНТБ) с той стороны, где будет происходить зажатие патча.
- Отодвиньте лезвие назад от ткани и открутите основание сцены назад так, чтобы брюшная поверхность была обращена к нему.
- Сделайте надрез, обозначающий ростральную поверхность клинового среза. Переложите срез на лист интерфейсной бумаги (1 см2) каудальной поверхностью вниз. Переместите ломтик в инкубационную камеру или другое подходящее инкубационное устройство для восстановления (30 минут при 35 °C).
заметка: Лицевой нерв должен быть виден на обоих полушариях разреза на ростральной поверхности (см. рисунок 1B).
