Стимуляция дифференцировки нейронных клеток с помощью золотых наностержней

Аннотация

Источник: Paviolo., et al. Оптическая стимуляция нейронных клеток с помощью золотых наностержней. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует технику стимулирования дифференцировки нейронов путем воздействия на нервные клетки золотых наностержней и лазерного света, который формирует клеточные проекции, поддерживаемые βIII-тубулином. Окрашивание и наблюдение за тубулином и клеточным ядром с помощью эпифлуоресцентной микроскопии выявляет клеточные выросты, что указывает на эффективность наностержней в дифференцировке нейронов.

Протокол

1. NG108-15 Культура и дифференцировка нейрональных клеточных линий

1. Для среды для культивирования клеток приготовьте 500 мл стерильной модифицированной среды Dulbecco Eagle Media (DMEM), содержащей 10% (w/v) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 1% (w/v) L-глутамина, 1% (w/v) пенициллина/стрептомицина и 0,5% (w/v) амфотерицина B.
   Примечание: Добавки можно аликвотировать, хранить при температуре -20 °C и добавлять в носители в нужный день. Среду для клеточных культур можно хранить в холодильнике в стерильном состоянии не более 1 месяца.
2. В качестве среды для дифференцировки клеток готовят 50 мл стерильного DMEM, содержащего 1% (w/v) L-глутамина, 1% (w/v) пенициллина/стрептомицина и 0,5% (w/v) амфотерицина B.
3. Выращивать нейрональные клетки NG108-15 в 10 мл среды для культивирования клеток в колбах Т75 из полистирола в инкубаторе с увлажненной атмосферой (5% CO2 при 37 °C). В норме посевной материал по 1,5-2 × 10^{по 5} ячеек в каждую колбу чтобы быть готовым через 3-4 дня. Меняйте среду для культивирования клеток каждые два дня.
   Примечание: Чтобы предотвратить генетический дрейф или вариацию, не используйте для экспериментов клетки старше пассажа 21
.
4. Когда 70-80% слияние в культуре, смените среду на теплую свежую среду для культивирования клеток. Механически отделите ячейки, осторожно постучав по дну сливающейся колбы. Не используйте трипсин.
5. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 600 x g и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл теплой среды для дифференцировки клеток.
6. Затравка 2 × 10⁴ клеток/^см2 в тканевой культуре полистирола 96 луночным планшетом с 200 мкл среды для дифференцировки клеток. Инкубируйте эксперимент в течение 1 дня при 5% CO2 / 37 °C.
7. Добавьте от 3,2 × 10⁹ - 4,2 ×¹⁰ частиц/мл раствора золотого наностержня (Au NR) на 2-й день и инкубируйте еще 24 часа. Не добавляйте частицы для контрольных экспериментов.
   Примечание: В качестве альтернативного контроля для сравнения можно использовать наночастицы золота (Au NPs) с хорошо дифференцированной длиной волны пикового поглощения.

2. Усиление нейритового отрастания

1. Соедините лазер с одномодовым оптическим волокном (числовая апертура = 0,13) и завершите его оптоволоконным разъемом (соединители FC удобны и общедоступны). Измерьте выходную мощность лазера с помощью стандартного измерителя мощности. Для получения наиболее эффективных результатов сопоставьте пиковую длину волны лазера с пиком плазмонного резонанса NR.
2. На 3-й день после инкубации NR закрепите разъем FC на лунке. Облучайте образцы и контрольные элементы в режиме RT в течение 1 минуты в непрерывной волне для лазеров различной мощности. Дайте культуре продолжить работу в течение 3 дней при 5% CO2 / 37 °C. Повторите лазерное облучение минимум для 3 независимых измерений.
   Примечание: В зависимости от области применения можно выбрать различное время облучения и частоту импульсов.
3. Характеристика лазера с точки зрения диаметра луча и лазерного излучения (Вт∙см-2).
   1. Для стандартного одномодового волокна используйте NA = n∙sinθ, где n — показатель преломления используемой среды, а θ — полуугол конуса света, выходящего из волокна (см. рисунок 1A). Из тригонометрии r = tanθ∙d, где r — радиус луча, а d — расстояние между волокном и образцом. Разъем ФК соответствует диаметру лунки, поэтому освещает образец на расстоянии d = 2,70 ± 0,20 мм. Свет выходит из волокна в воде (n = 1,33), давая r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. Используя последнее уравнение, рассчитайте радиус лазерного луча, соответствующую площадь луча и среднее лазерное излучение (мощность лазера, деленная на площадь луча) на мишени (см. пример графика на рисунке 1B). Эти значения представляют собой среднюю степень излучения по освещаемой области.
   3. Оцените погрешности измерений с помощью общей теории распространения ошибок.
      Примечание: Расстояние между разъемом FC и образцом может быть измерено с помощью фотографий экспериментального расположения и последующей обработки изображения с использованием соответствующего программного обеспечения (например, ImageJ).
4. На 5-й день удалите из экспериментов среду для дифференцировки клеток и зафиксируйте образцы 3,7% (v/v) раствором формальдегида на 10 минут, затем пропитайте клетки 0,1% (v/v) Triton X-100 в течение 20 минут.
5. Добавьте 3% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в образцы в течение 60 минут, чтобы блокировать непрореагировавшие сайты связывания белка. Пометьте образцы на анти-βIII-тубулин в течение ночи (5 мкг/мл в PBS с добавлением 1% BSA) при 4 °C.
6. Инкубируйте клетки в течение 90 минут в темноте с подходящим вторичным антителом (например, TRITC(тетраметилродамином)-конъюгированным антителом IgG к мышам) с использованием концентрации 0,4-2 мкг/мл в 1% BSA в PBS. Пометьте ядра клеток DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) (0,1 мкг/мл в деионизированной воде) в течение 10 мин.<бр/> Примечание: Конъюгация и концентрация антител могут варьироваться в зависимости от протокола компании. Промойте образцы PBS дважды в течение 5 минут после каждого этапа окрашивания.
7. Изображения образцов с помощью эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии с использованием объектива не менее 20×. Выбирайте фильтры микроскопа в соответствии с вторичными антителами. Выберите фильтр DAPI (λEX = 358 нм; λEM = 488 нм) для визуализации ядра клетки.
8. Проанализируйте изображения, оценив: 1) максимальную длину нейритов (запишите длину от кончика нейрита до начала тела клетки), 2) количество нейритов на нейронную клетку (суммируйте все нейриты на клетку) и 3) процент клеток с нейритами (разделите общее количество клеток, экспрессирующих βIII-тубулин, на общее количество клеток с положительно окрашенным ядром)

Результаты

Рисунок 1. Экспериментальная установка оптического волокна (А) и средние лазерные излучения в зависимости от мощности лазера для лазерного луча площади равны 0,4 мм2 (В). Параметрами луча являются (A): полуугол максимального конуса света, выходящего из волокна (θ), радиус луча (r) и расстояние между оптическим волокном и образцом (d).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Au NR	Сигма Олдрич	716812
НГ108-15	Сигма Олдрич	8811230
DMEM	Сигма Олдрич	Д6546
ФТС	Технологии Life	10100147
L-глютамин	Сигма Олдрич	Г7513
Пенициллин/стрептомицин	Технологии Life	15140122
Амфотерицин В	Технологии Life	15290018
формальдегид	Сигма Олдрич	Ф8775
Тритон Х-100	BDH	Т8532
БСА	Сигма Олдрич	А2058
Анти-βIII-тубулин	Компания Promega	Г7121
TRITC-конъюгированное антитело IgG к мышам	Сигма Олдрич	Т5393
DAPI	Инвитроген	Д1306
УФ-ВИД спектрометр	Вариан Медикал Системс Инк.	Биография Кэри 50
Мини-центрифуга	Эппендорф	Мини Спин
Звуковая ванна	Unisonics Россия	FPX 10D
Инкубатор для клеточных культур	Кендро	Гера Клетка 150
Центрифуга для клеточных культур	Хеттих	Rotofix 32А
Лазерный диод	Оптотех	780 нм одномодовый оптоволоконный LD
Оптическое волокно	Торлабс	780 л.с
Измеритель мощности	когерентный	Лазерная проверка
ИзображениеJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Эпифлуоресцентный микроскоп	Аксон Инструменты	ImageX-пресс 5000А
ПБС
Пластина из полистирола 96 лунок
СО2
Колбы Т75