Получение первичных культур ганглиозных клеток сетчатки из эмбрионов данио-рерио

Аннотация

Источник: Терзи, А., и др., Визуализация живых клеток ROS во время развития нейронов. J. Vis. Exp. (2021)

Видео демонстрирует метод культивирования первичных ганглиозных клеток сетчатки из эмбрионов рыбок данио. Эмбрионы на ранних стадиях подвергаются вскрытию для изоляции глаз, которые впоследствии механически диссоциируются в суспензию ганглиозных клеток сетчатки. Эта клеточная суспензия культивируется на покровных стеклах, покрытых адгезивными белками для облегчения развития аксонов.

Протокол

1. Приготовление растворов

1. Медиа E2 (1 шт.)
   1. Приготовьте 100x E2A (500 мл), 500x E2B (100 мл) и 500x E2C (100 мл), комбинируя все компоненты, показанные в таблице 1. Автоклавные решения E2A, E2B и E2C. Хранить при температуре 4 °C.
   2. Для 1x E2 среды: Объедините 5 мл 100x E2A, 1 мл 500x E2B и 1 мл 500x E2C. Доведите объем до 500 мл стерильной водой. Отрегулируйте pH до 7,0-7,5.
   3. Приготовьте 50 мл аликвот 1x Е2 среды и храните при температуре -20 °C для длительного хранения. Однако после оттаивания могут выпасть осадки. Перед использованием стокового раствора убедитесь, что осадки полностью растворились.

Таблица 1: Компоненты 1x E2 среды для культивирования клеток рыбок данио

.

решение	компонент	количество	концентрация
100X E2A (500 мл)
	NaCl	43,8 г	1500 мМ
	KCl	1,88 г	50 мМ
	MgSO4	6 г	100 мМ
	КХ2ГО4	1,03 г	15 мМ
	Na2HPO4	0,34 г	5 мМ
500X E2B (100 мл)
	CaCl2	5,5 г	500 мМ
500X E2C (100 мл)
	НаОГС3	3 г	350 мМ
1X E2 (500 мл)
	100X E2A	5 мл	В 1 раз
	500X E2B	1 мл	В 1 раз
	В 500 раз E2C	1 мл	В 1 раз

2. Медиа E3 (1 шт.)
   1. Растворите компоненты в 1 л стерильной воды, как показано в таблице 2, чтобы получить 100-кратный запас. Разведите бульон в стерильной воде до получения 1x Е3 среды.
   2. Добавьте 0,2% метиленового синего. На 20 мл 1x Е3 среды добавьте 40 мкл метиленового синего.

Таблица 2: Компоненты 100-кратной среды E3 для поддержания эмбрионов рыбок данио.

См. См.

компонент	Сумма (г)	Концентрация в запасе 100X (мМ)
NaCl	29,22	500
KCl	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
MgSO4 7H2O	8.13	33

3. 80x солевой раствор
   1. Объедините все компоненты, показанные в таблице 3. Добавьте воды, чтобы получилось 100 мл раствора. Перемешивайте до полного растворения всех компонентов. Хранить раствор при температуре 4 °C.

Таблица 3: Компоненты 80-кратного солевого раствора для среды для культивирования клеток рыбок данио

. См.

компонент	Сумма (г)	Концентрация в запасе (мМ)
глюкоза	1.44	80
Пируват натрия	0,44	40
CaCl2 2H2O	0,148	10
ХЕПЕС	6,1	256

4. Питательная среда для клеточных культур рыбок данио (ZFCM+)
   1. Соедините все компоненты, показанные в таблице 4, чтобы получить среду объемом 250 мл. Отрегулируйте pH до 7,5. Фильтруйте материал с помощью фильтра 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C.

Таблица 4: Компоненты среды для культивирования клеток рыбок данио с сывороткой и антибиотиками.

См См. Ст. См.

компонент	Количество (мл)	Объем, %
L-15 средний (с феноловым красным)	212,75	85,1
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	5	2
Пенициллин/стрептомицин	1	0,4
80X солевой раствор	3.125	1.25
Вода	28 .125	11.25

2. Первичная культура ганглиозных клеток сетчатки, полученная из эмбрионов данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.1 и 2.2 в колпаке с ламинарным потоком.

1. Подготовка чехлов
   1. В каждом опыте подготавливайте по 4-6 культуральных тарелок. Используйте очищенные кислотой покровные стекла (квадрат 22 x 22 мм; толщина 0,16-0,19 мм), которые хранятся в 100% этаноле.
   2. Снимите одну защитную крышку с контейнера для хранения с помощью щипцов и подожгите ее, чтобы удалить остатки этанола.
   3. Полностью высушите покровное стекло на воздухе, поместив его под углом внутрь 35-миллиметровой чашки для культивирования.
   4. Приготовьте рабочий раствор поли-D-лизина (PDL) (1x), разбавив 10x stock (5 мг/мл) в стерильной воде.
   5. Нанесите 100 мкл 0,5 мг/мл PDL на центр каждого покровного стекла и избегайте растекания раствора по краям.
   6. Инкубируйте PDL на покровных стеклах в течение 20-30 минут при комнатной температуре (RT). Следите за тем, чтобы PDL не пересыхал.
   7. Промойте PDL 0,5 мл стерильной водой три раза. Дайте пластинам полностью высохнуть.
   8. Приготовьте рабочий раствор ламинина (1x), разбавив 50x stock (1 мг/мл) в 1x PBS.
   9. Нанесите 100 мкл 20 мкг/мл ламинина в PBS на центр каждого покровного стекла и не допускайте растекания раствора по краям.
   10. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе в течение 2-6 ч. Избегайте высыхания раствора ламинина.
2. Диссекция эмбрионов и гальваническое покрытие RGC
   1. Приготовьте и промаркируйте четыре 35-мм чашки для культуры тканей и заполните 4 мл следующими продуктами: 70% этанола, «Е2 медиа 1», «Е2 медиа 2», «Е2 медиа 3» в день вскрытия. Храните посуду в холодильнике до вскрытия.
   2. Когда эмбрионы рыбок данио-рерио пройдут через 34 часа после оплодотворения (HPF), достаньте из инкубатора чашки для культивирования, покрытые ламинином, и трижды промойте покровные стекла 0,5 мл 1x PBS.
   3. После окончательной промывки добавьте 4 мл фильтрующего материала ZFCM(+) в каждую чашку для культур и избегайте пересыхания тарелки.
   4. Извлеките приготовленные блюда из Шага 2.2.1. Пусть уравновешивают до RT.
   5. Заполните 4-6 пробирок для ПЦР 15 мкл среды ZFCM(+). Одна пробирка нужна для приготовления РГК из 4 глазков, которые будут нанесены на один покровный лист.
   6. Извлеките эмбрионы рыбок данио из инкубатора и погрузите эмбрионы в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 70% этанола, на 5-10 секунд для стерилизации.
   7. С помощью пипетки для переноса перенесите эмбрионы в чашку E2 Media 1, содержащую стерильную среду E2, чтобы смыть излишки этанола.
   8. Перенесите эмбрионы в чашку E2 Media 2 и удалите их хорионы острыми щипцами.
   9. Перенесите эмбрионы в конечную чашку E2 Media 3 для проведения вскрытия.
   10. С помощью пары тонких щипцов рассеките сетчатку.
   11. Расположите и удерживайте эмбрионы перед их желтком с помощью одного из щипцов, а хвост сзади желточного мешка удалите с помощью других щипцов.
   12. Обхватите шею щипцами и снимите голову, чтобы подвергнуть мозг и глаза воздействию среды Е2. Избегайте разрезания желточного мешка.
   13. Кончиком тонких щипцов осторожно скатите глаза с головы, удерживая при этом ткань черепа вниз вторыми щипцами. Держите глаза изолированными от остатков прилегающих тканей.
   14. Перенесите четыре глаза в одну из заранее подготовленных пробирок с ZFCM(+).
   15. Осторожно титруйте вверх и вниз с помощью пипетки P20 и желтого наконечника около 45 раз, чтобы диссоциировать клетки. Избегайте попадания пузырьков воздуха.
   16. Перенесите ZFCM(+) с диссоциированными ячейками в центр покровного стекла. Повторите шаги 10-12 для получения дополнительных защитных колпачков.
   17. Поддерживайте культуру на столе при температуре 22 °C на штативе из пенополистирола для поглощения вибраций.
   18. Выполните визуализацию через 6-24 часа после нанесения покрытия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35-мм чашка для культивирования	Сарштедт	83-3900
Дигидрат хлорида кальция	Научный центр Фишера	С79-500
Покровное стекло	Корнинг	2850-22
Одноразовые чашки Петри (100 x 15 мм)	ВВР	25384-094 (Английский)
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFisher Scientific	26140087
глюкоза	Сигма Алдич	Г7528
ХЕПЕС	Сигма Алдич	Н4034
Ламинин	ThermoFisher Scientific	No 23017-015
Leibovitz's L-15 Medium без фенола красного	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027 (Английский
ПБС	Гиклон/Фишер Сайентиал	SH3025601
Пенициллин/стрептомицин	ThermoFisher Scientific	15140122
Поли-D-лизин (PDL)	Сигма Алдич	П7280
Пируват натрия	Сигма Алдич	П5280
Фильтр Steritop 0,22 мкм	Многородность	S2GPT05RE

гг. )