Рост и дифференцировка нейронов, нагруженных магнитными наночастицами, на магнитных платформах

Аннотация

Источник: Indech, G., et al. Изготовление магнитных платформ для организации взаимосвязанных нейронов в микронном масштабе. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует поглощение флуоресцентных магнитных наночастиц (MNP) нейрональными клетками через эндоцитоз. Выращивание этих нейронов, нагруженных MNP, на подложке с магнитной структурой позволяет прикреплять клетки. Добавление фактора роста, содержащего среду, способствует росту нейронных расширений, в то время как магнитное поле субстрата определяет ориентацию расширения.

Протокол

1. Поглощение клеточных магнитных наночастиц (MNP)

1. Приготовьте основную питательную среду для клеточной культуры PC12, добавив 10% лошадиной сыворотки (HS), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина и 0,2% амфотерицина в среду Медицинского института Розуэлл Парк (RPMI), и отфильтруйте с помощью нейлонового фильтра 0,22 мкм.
2. Добавьте 1% лошадиной сыворотки (HS), 1% L-глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина и 0,2% амфотерицина в среду RPMI для приготовления дифференцировочной среды PC12 и отфильтруйте с помощью нейлонового фильтра 0,22 мкм.
3. Выращивайте клетки в необработанной культуральной колбе с 10 мл основной питательной среды; добавляйте 10 мл основной питательной среды в колбу каждые 2-3 дня и субкультивируйте клетки через 8 дней.
4. Для поглощения клетками суспензию клеток центрифугируют в центрифужной пробирке в течение 8 мин при 200 × г и комнатной температуре, а надосадочную жидкость выбросить.
5. Ресуспендируйте клетки в 3 мл свежей основной питательной среды. Снова центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 200 × г и комнатной температуре, и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 3 мл свежей среды для дифференцировки.
6. Аспирируйте клетки 10 раз с помощью шприца и иглы, чтобы разбить клеточные кластеры. Посчитайте клетки с помощью гемоцитометра, и засейте^10-6 клеток в обычную непокрытую 35 мм чашку.
7. Добавьте в чашку рассчитанный объем суспензии MNP и объем дифференцировочной среды для достижения желаемой концентрации MNP и общего объема. Смешайте клетки, MNP и среду для дифференцировки; Инкубировать чашку в увлажнённом инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C в течение 24 часов.
8. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 200 × г при комнатной температуре, а надосадочную жидкость выбросьте. Ресуспендируйте клетки в 1 мл свежей среды для дифференцировки и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

2. Дифференцировка и рост клеток на магнитной платформе

1. Очистите узорчатую подложку 70% v/v/этанолом и поместите субстрат в чашку для культур диаметром 35 мм в колпаке. Поместите большой магнит (~1500 эрстед) ниже узорчатой подложки на 1 минуту и удалите магнит, сначала переместив тарелку вверх и в сторону от магнита, а затем выньте магнит из вытяжки. Включите ультрафиолет на 15 минут.
2. Покрыть субстрат коллагеном типа 1, разбавив коллаген типа 1 (раствор из крысиного хвоста) в соотношении 1:50 в 30% v/v этаноле. Чтобы покрыть чашку диаметром 35 мм, добавьте 20 мкл коллагена к 1 мл 30% этанола.
3. Залейте блюдо раствором, и подождите, пока весь раствор испарится, оставив блюдо открытым на несколько часов. Стирать 3x в стерильном 1x PBS; Предметное стекло готово к засеву клеток.
4. Суспензируйте клетки после поглощения клеточным МНП, засейте^10-5 клеток в культуральную чашку диаметром 35 мм и добавьте 2 мл дифференцировочной среды. Инкубируйте культуру в 5% CO2, увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C.
5. Через 24 часа добавьте 1:100 свежего мышиного β-NGF (конечная концентрация 50 нг/мл). Обновляйте среду для дифференцировки и добавляйте свежую мышиную β-NGF каждые 2 дня.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночный планшет для культивирования клеток	сокол	353846
96-луночный планшет для культивирования клеток	SPL медико-биологические науки	30096 (Английский
Раствор амфотерицина В	Биологическая промышленность	03-028-1Б
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Биологическая промышленность	03-010-1Б
Колба для культивирования клеток и тканей	Биофил	TCF002250	75,0 см^2 250 мл Вентиляционный колпачок, необработанный
Чашка для клеточных культур	Greiner Bio-One	627-160	35 мм
Центрифужная трубка	Биофил	CFT021500	50 мл
Коллаген I типа	Компания Corning Inc.	354236	Крысиный хвост, диапазон концентраций 3-4 мг/мл
Одноразовая игла	KDL		23 Г
Одноразовый шприц	Медиспо	1160227640	10 мл
Донорская сыворотка лошади	Биологическая промышленность	04-124-1А
Этанол 70%	ООО «РОМИКАЛ»	19-009102-80
Абсолютный этанол (обезвоженный)	Биолаборатория-химикаты	52505
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Биологическая промышленность	04-127-1А
Свежая мышиная β-NGF	Пепротех	450-34
Электромагнит GMW с С-образной рамой.	Бакли Системс Лтд		3470, 45 мм
L-глютамин	Биологическая промышленность	03-020-1Б
PBS 10x	Хайлабы	БП507/1ЛД
Клеточная линейка PC12	АТКС	ЦРЛ-1721
Раствор пенициллин-стрептомицина нистатина	Биологическая промышленность	03-032-1Б
RPMI 1640 с L-глютамином	Биологическая промышленность	01-100-1А

) гг.