$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Получение пластин с покрытием из матрицы базальной мембраны, отвечающих требованиям эмбриональных стволовых клеток человека (hESC)
- Медленно размораживайте квалифицированный hESC раствор матрицы базальной мембраны (см. Таблицу материалов) при температуре 4 °C в течение не менее 2–3 часов или в течение ночи, чтобы избежать образования геля.
- Для приготовления пластин с матричным покрытием базальной мембраны разбавьте матрицу в холодной модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle с F12 (DMEM+F12) до конечной концентрации 2%. Хорошо перемешайте и покройте каждую лунку 6-луночного планшета 1 мл разбавленного матричного раствора.
- Планшеты с матричным покрытием базальной мембраны инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение не менее 3 ч или при 4 °C в течение ночи.
заметка: Планшеты с матрицей базальной мембраны можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели до удаления раствора матрицы и использования пластин.
2. Адаптация hESCs колонийного типа к культуре hESC одиночных клеток
- Для прохождения беспитательных культур колонии типа H9 (WA09) hESCs, выращенных на матрице базальной мембраны, отсасывают среду из лунок (рис. 1А).
- Умойтесь 1x с 1 мл DPBS. Добавьте 1 мл раствора диспазы (1 Ед/мл) в лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут.
- Удалите диспай, аккуратно промойте ячейки 1 раз 2 мл DMEM/F12, удалите среду и добавьте по 2 мл DMEM/F12 на каждую пластину.
- Аккуратно отделите колонии с помощью осторожного пипетирования вверх и вниз и переложите в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте гранулы в течение 2 минут при давлении 370 x g и отсасывайте среду.
- Чтобы диссоциировать клеточные гранулы на отдельные клетки, добавьте 2 мл раствора для отделения клеток (1x концентрация, см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут.
- Центрифугируйте ячейки в течение 2 мин при 370 x g и удалите раствор для отслоения.
- Добавьте свежую среду mTeSR1 для человека и диссоциируйте клетки на отдельные клетки путем осторожного пипетирования вверх и вниз.
- Чтобы адаптировать hESCs колонийного типа к культуре одноклеточного типа, поместите приблизительно 1,5–2,0 x 106 hESCs в каждую лунку 6-луночного планшета, покрытого базальной мембраной, в 2 мл mTeSR1, содержащего 10 μM ингибитора ROCK, в течение 24 ч (рис. 1A).
- Через 24 ч замените среду hESC свежим mTeSR1 без ингибитора ROCK и дайте hESCs расти как одноклеточный тип в течение 3 дней. Меняйте среду ежедневно.
- На 4-й день, когда культуры достигнут почти 100% конфлюенции, диссоциируйте клетки в растворе для отслойки, затем перепланируйте клетки, как описано в шаге 2.6.
заметка: Ингибитор ROCK улучшает выживаемость клеток в течение начальных 24 ч культивирования hESC одноклеточного типа.
3. Дифференцировка одноклеточного типа hESCs в NPC (Рисунок 2)
- Чтобы индуцировать дифференцировку NPC, диссоциировать hESCs одноклеточного типа с 1 мл раствора отслойки (1x) и инкубировать в течение 10 мин при 37 °C.
- Центрифугируйте клетки в течение 2 мин при 370 х г и удалите надосадочную жидкость из раствора отслойки. Добавьте 1 мл DMEM/F12 и ресуспендируйте клетки с помощью щадящего пипетирования.
- Пластинчатые ячейки на базальной мембране покрыты матричным покрытием из 6-луночного планшета плотностью 2 x 10 5 клеток/лунка в 2 мл mTeSR1, содержащего 10 мкМ ингибитора ROCK.
- Через 24 ч питательную среду заменить средой для нервной индукции (DMEM с 1% B27 минус витамином A) с добавлением 1 мкМ дорсоморфина и 5 мкМ SB431542.
- Меняйте среду через день в течение первых 4 дней нейронной индукции, затем каждый день до достижения слияния на 7-й день (рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Дорсоморфин ингибирует путь BMP, нацеливаясь на рецепторы ALK2,3,6, а также ингибирует AMPK; SB431542 является ингибитором пути TGFβ/Activin, нацеливаясь на ALK5,7. (2) Тот же протокол был протестирован с другой линией ESC (WA01), которая дала результаты, аналогичные WA09. (3) Мы обычно использовали Matrigel для матрицы базальной мембраны; тем не менее, клетки могут быть культивированы на Geltrex и затем дифференцированы в NPC с очень похожими результатами, о чем свидетельствует экспрессия нескольких маркеров NPC (рисунок 3D, E). Обращайтесь с Geltrex так же, как и с Matrigel (см. раздел 1).
