Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Стерилизация материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы и растворы должны быть стерилизованы перед использованием.
- Стерилизуйте все хирургические инструменты и материал для вибратомной резки (держатель ножа, диск для образцов, буферный лоток) в сушильном стерилизующем шкафу в течение 4 часов при температуре 180 °C.
- Стерилизуйте чувствительные к температуре материалы или оборудование с помощью ультрафиолетового или гамма-излучения.
- Стерилизация сред и растворов путем автоклавирования или фильтрации через пористые мембраны толщиной 0,22 мкм.
2. Приготовление растворов
- Приготовьте 15-20 мл транспортного раствора: 50% v/v сбалансированный солевой раствор Hanks' Balanced Salt (HBSS) pH 7,4, 50% v/v базальную среду для поддержания нейронов постнатального и взрослого мозга (Таблица материалов), с добавлением 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES), 3 мг/мл глюкозы и 33 мкг/мл гентамицина.
заметка: Транспортировочный раствор должен быть охлажден и насыщен кислородом (барботирование карбогеном) не менее чем за 20 минут до отбора пробы.
- Приготовьте 300 мл раствора для нарезки (HBSS с добавлением 10 мМ HEPES и 3 мг/мл глюкозы) и охладите его в морозильной камере до начального кристаллообразования.
- Приготовьте 20 мл питательной среды: базальную среду для поддержания нейронов головного мозга в постнатальном периоде и у взрослого человека (Таблица материалов) с добавлением 1% производного L-глутамина (Таблица материалов), 2% добавку для культуры нейронов (Таблица материалов), 1% пенициллин/стрептомицин и 0,25 мкг/мл амфотерицина В.
3. Настройка устройства для нарезки
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол идеально выполняется с помощью коллеги из-за логистики сбора образцов в хирургической комнате.
- В ведре со льдом с добавлением соли дайте раствору для нарезки постоять под барботированием карбогеновой смеси (95%O2, 5%CO2) не менее 20 минут перед использованием.
- Приготовьте блок из 3% агарозы (примерно 2 см x 2 см x 2 см) и приклейте его суперклеем к диску образца вибратома, чтобы создать дополнительную механическую поддержку образцу ткани во время нарезки (рис. 1E).
- Установите вибратом для нарезки: толщина сечения 200 мкм, частота вибрации 100 Гц, скорость нарезки в пределах 0,5-1,0 мм/с.
- Зафиксируйте буферный лоток вибратома на основании вибратома и добавьте лед, чтобы сохранить его в холодильнике перед получением раствора для нарезки и образца, а также на протяжении всей процедуры нарезки.
4. Сбор образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе человеческая неокортикальная ткань была собрана в операционной и доставлена в лабораторию.
>ВНИМАНИЕ: При работе с человеческими образцами следуйте соответствующим протоколам безопасности, установленным Учреждением.
- Сконфигурируйте транспортное устройство (рис. 1С), которое состоит из: переносного газового баллона с карбогенной смесью, подключенного к клапану давления/потока, который контролирует выход газа, подключенного к силиконовой трубке, соединяющей выход газа с транспортировочным сосудом; транспортного сосуда, обычно конической центрифужной трубки объемом 50 мл с перфорированной крышкой для подачи газа; содержащий транспортный раствор; и лед для охлаждения образцов во время транспортировки.
- Соберите и транспортируйте образец (рис. 1B) сразу же в лабораторию. Погрузите образец в холодный транспортный раствор (постоянно пузырчатый с карбогенной смесью).
5. Нарезка
- Перенесите образец в чашку Петри (100 мм x 20 мм), содержащую раствор для нарезки, и с помощью тонких хирургических инструментов осторожно удалите как можно больше оставшихся мозговых оболочек в образце (рис. 1D).
- Выберите наилучшую ориентацию образца для производства срезов с учетом особенностей экспериментальной конструкции и с помощью лезвия скальпеля No 24 обрежьте плоскую поверхность, которая будет основанием для приклеивания к диску образца.
- С помощью одноразовой пластиковой ложки и нежных кистей соберите фрагмент из чашки Петри и высушите излишки раствора с помощью фильтровальной бумаги (сушите по капиллярности и избегайте касания фрагмента ткани бумагой).
- С помощью суперклея приложите ткань к диску образца вибратома до тех пор, пока она не будет прочно приклеена к диску и не соприкоснется с агарозным блоком (рисунок 1E).
- Поместите диск с образцом вибратома (с правильно прикрепленной тканью) в буферный лоток вибратомии, наполненный раствором для нарезки, который должен пузыриться в течение всего процесса.
- Зафиксируйте держатель ножа на месте, плотно зафиксировав лезвие бритвы.
- Раствор для нарезки должен покрыть как образец, так и лезвие, только после этого приступайте к нарезке (рис. 1F).
- Нарежьте образец на ломтики размером 200 мкм.
заметка: Несмотря на то, что некоторые вибротомы режут образцы автоматически, тщательное наблюдение и незначительные корректировки скорости нарезки во время процесса могут помочь получить более качественные ломтики. Отбросьте первоначальные неровные ломтики.
- Переложите ломтики из буферного лотка в чашку Петри с раствором для нарезки и обрежьте свободные края и излишки белой материи до пропорции около 70% коры и 30% белого вещества.
6. Культура
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в ламинарном шкафу в стерильной среде.
- Добавьте 600 мкл питательной среды в лунку (в 24-луночный планшет) и инкубируйте не менее 20 мин при 36 °C и 5%CO2 перед нанесением на ломтики.
- Выложите на тарелку по одному ломтику на лунку с помощью кисти (рис. 1G).
- Если в пластине есть неиспользованные лунки, заполните их 400 мкл стерильной воды.
- Инкубируйте планшет при 36 °C, 5% CO2,
заметка: Первая замена среды должна быть выполнена через 8-16 часов после нанесения покрытия, в зависимости от размера ломтика.
- Добавьте 10 мл ранее приготовленной питательной среды с 50 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF).
заметка: В течение первых 8-16 ч ломтики инкубируют в 600 мкл среды, чтобы избежать обездоления питательных веществ и подкисления, так как потребление среды в этой фазе ускоряется. Со следующего шага объем среды на лунку доводится до 400 μл.
- Удалите 333 мкл кондиционированной среды из каждой лунки и добавьте 133 мкл свежей среды, добавленной BDNF.
- Повторяйте процесс замены среды каждые 24 часа, заменяя одну треть кондиционированной среды свежей средой с добавлением BDNF.
