Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Готовим чашку Петри для иммунопаннинга CD11b (день 0)
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1 блюдо для иммунопанорамирования на каждые 1 - 2 мозга молодых крыс.
- Добавьте 25 мл 50 мл раствора Tris pH 9,5 в чашку Петри диаметром 15 см.
- Добавьте в чашку козий антимышиный IgG (цепи H+L) до конечной концентрации 6 мкг/мл. Закрутите пластину для равномерного распределения.
- Инкубируйте чашку в течение 1–3 часов при температуре 37 °C.
- Посуду трижды ополоснуть DPBS++ (фосфатно-солевой буфер (PBS) с Ca2+ и Mg2+), затем заменить раствором промежуточного буфера, содержащим 1 мкг/мл антитела OX42. Оставьте посуду на ночь при комнатной температуре на ровной поверхности.
2. Сбор тканей (День 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен занять ~3 - 4 часа.
- Прежде чем начать, убедитесь, что все растворы стерильны и охлаждены на льду. Охладите все инструменты на льду и простерилизуйте этанолом перед использованием.
- Следуя соответствующим регламентирующим процедурам, принесите в жертву молодую лабораторную крысу путем удушения углекислым газом.
заметка: В качестве альтернативы, молодые животные могут быть умерщвлены смертельной дозой кетамина/ксилазина (100 - 200 мкл 24 мг/мл кетамина, 2,4 мг/мл ксилазина). Кетамин/ксилазин необходимо использовать, если животные младше 14 дней. При использовании нескольких животных извлеките ткань у одного животного и поместите ее в предварительно охлажденную DPBS++ на льду, прежде чем приступать к последующим животным.
- Зажмите заднюю лапу и убедитесь в полной реакции со стороны животного, прежде чем приступить к работе.
- Транскардиально перфузируйте животное 10 - 30 мл ледяного перфузионного буфера с помощью иглы 271/2-G до тех пор, пока буфер не станет прозрачным.
заметка: Объем перфузионного буфера будет варьироваться в зависимости от размера/возраста животного.
- Сразу после перфузии удалите голову животного. Входя из спинного мозга, разрежьте затылочный мыщелок с каждой стороны ножницами для вскрытия, будьте осторожны, чтобы не повредить головной мозг. Аккуратно разрезав каждую сторону, разрежьте одну сторону вдоль теменной и лобной кости по направлению к носовой кости. С помощью щипцов осторожно оттяните верхнюю часть черепа, быстро удалите мозг (или интересующие структуры ЦНС) и поместите в предварительно охлажденный DPBS++ на лед.
- Повторите то же самое для всех оставшихся животных.
заметка: Все последующие шаги должны выполняться в ламинарном вытяжном шкафу в надлежащих стерильных условиях.
3. Механическая диссоциация (День 1)
- После того, как все мозги собраны, один мозг измельчить на3 части размером 1 мм в чашке Петри на льду холодным лезвием скальпеля и переложить в ледяной гомогенизатор с 5 - 7 мл ледяного буфера. Диссоциируйте по одному мозгу за раз.
- Диссоциируйте ткань с помощью 10 - 20 легких и неполных движений с помощью свободно прилегающего гомогенизатора. Следите за тем, чтобы не раздавливать ткань в нижней части гомогенизатора, а вместо этого проталкивать ткань через пространство между боковыми сторонами поршня и гомогенизатора.
- Осторожно снимите поршень, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха. Дайте плохо диссоциированным тканевым фрагментам осесть на дно гомогенизатора и перенесите надосадочную жидкость в новую охлажденную коническую пробирку объемом 50 мл.
- Замените удаленный объем свежим буфером и повторяйте шаги 3.2 и 3.3 в общей сложности 3-4 раунда или до тех пор, пока вся ткань не будет диссоциирована. Повторите процедуру для каждого мозга.
4. Удаление миелина (День 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление миелина используется для выделения микроглии от животных старше P12.
- Измерьте объем клеточной суспензии в конической пробирке объемом 50 мл с помощью пипетки объемом 25 мл, затем добавьте ледяной буфер, чтобы довести общий объем до 33,5 мл.
- Добавьте в клеточную суспензию 10 мл буфера для разделения миелина (MSB) и тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. Это приведет к 23% конечной концентрации MSB в объеме 43,5 мл.
- Центрифуга в ячейках в течение 15 мин при 500 x g при 4 °C с медленным торможением.
заметка: Для замедления центрифуги должно потребоваться примерно 1,5 - 2 минуты. Это приведет к образованию верхнего слоя миелина и остатков мертвых клеток, несколько мутного надосадочной жидкости и более мелкой гранулы, обогащенной живыми клетками.
- Удалите верхний слой миелина/мусора и надосадочную жидкость с помощью пипетки. Будьте осторожны при снятии верхнего слоя, чтобы убедиться, что он удален как можно больше.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 12 мл проволочного буфера. Осторожно растирайте клеточную суспензию, чтобы разбить любые скопления клеток, которые могут остаться.
5. Иммунопанорамирование (День 1)
- Пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр толщиной 70 мкм, чтобы удалить крупный мусор или клеточные комки.
- Трижды промойте форму, покрытую покрытием OX42, с помощью DPBS++. Не допускайте полного высыхания пластины между стирками.
- Слейте последнюю промоутерную жидкость DPBS++ и нанесите отфильтрованную клеточную суспензию на форму для засолки. Осторожно покрутите пластину, чтобы распределить клетки, затем инкубируйте пластину на плоской поверхности при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы клетки прилипли. Не инкубируйте дольше 20 минут, иначе клетки будет очень трудно извлечь из чашки.
- Промойте форму для заваривания с помощью DPBS++ 10 раз, чтобы удалить неприлипшие клетки. Микроглия будет прочно прикреплена к пластине, поэтому поворачивайте пластину при каждом полоскании, чтобы обеспечить удаление других неадгезивных клеток.
- Слейте последнюю стирку DPBS++ и замените на 15 мл DPBS++ и 200 мкл трипсина (1,25% стоковый раствор).
- Выдержать чашку в течение ≤10 минут при температуре 37 °C с 10% CO2 для трипсинизации.
заметка: Не продолжайте дольше 10 минут, иначе микроглию будет трудно удалить.
- Через 10 минут трипсинизации микроглия все еще будет прилипать к пластине. Слейте трипсин/DPBS++ и аккуратно промойте 2 раза DPBS++, чтобы удалить трипсин, замените 12 мл ледяной среды для роста микроглии (MGM).
- Поместите форму для замывки на лед на 2 минуты, чтобы ослабить взаимодействие клеток и субстрата, и убедитесь, что форма плоская, чтобы предотвратить высыхание участков формы для замысывания.
- Энергично пипетируйте с помощью 10 мл дозатора и контроллера пипетки на высокой скорости для извлечения клеток из продувочной чашки. Нарисуйте сетку 16 х 16 с потоком жидкости из пипетки, чтобы попытаться удалить все ячейки.
- Проверьте клетки под микроскопом при 20-кратном увеличении, чтобы убедиться, что клетки оторвались от пластины. Отметьте на верхней части чашки места, где еще застряли клетки, и повторите пипетирование в этих областях.
- Соберите клеточную суспензию и аликвоту 3 - 4 мл надосадочной жидкости на 15-мл конической пробирки. Вращение в течение 15 минут при 500 x g при 4 °C с медленным торможением.
заметка: Вращение микроглии через небольшой объем позволяет добиться максимального восстановления клеток.
- Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя 0,5 мл MGM вместе с клеточной гранулой.
- Повторно суспендируйте каждую гранулу в оставшейся MGM и объедините элементы из всех пробирок.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Пластинчатые элементы в соответствии с шагами 6 - 7 в зависимости от области применения.
- Культивирование клеток при 37 °C с 10% CO2,
заметка: Клетки можно культивировать в течение 3-4 недель при регулярной смене среды или в течение одной недели без смены среды.
6. Планшеты для культуры тканей с точечным покрытием (День 1)
- Планшет объемом 15 мкл коллагенового покрытия IV помещают непосредственно в центр 24-луночного тканевого планшета с анионным/катионным покрытием (подробнее см. Таблицу материалов) и инкубируют в течение 15 минут при 37 °C с 10%CO2.
- После подсчета клеток с помощью гемоцитометра разбавьте клетки до 2,3 х 105/мл в MGM. Аспирируйте коллаген внутривенно и немедленно наложите на это место 15 мкл клеточной суспензии; Это даст 3,5 х 103 клетки/пятно. Инкубировать в течение 5 - 10 минут при 37 °C с 10%CO2, чтобы клетки прилипли, осторожно добавить в лунку 500 μL CO2-уравновешенной TGF-β2/IL-34/холестериновой питательной среды (TIC).