Методическая статья

Препарирование срезов головного мозга методом защитного восстановления на основе NMDG

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Ting, J. T. et al. Приготовление острых срезов мозга с использованием оптимизированного метода защитного восстановления N-метил-D-глюкамина. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео описывается протокол получения срезов мозга с использованием метода защитного восстановления на основе N-метил-D-глюкамина (NMDG). Расчлененный мозг инкубируют в аCSF с NMDG и HEPES, чтобы свести к минимуму гибель и повреждение нейрональных клеток во время разрезания. Секция разрешается восстанавливаться в аКСФ для восстановления клеточной активности

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Рассечение и срез мозга

  1. Обезглавьте животное. С помощью скальпеля вскройте кожу на голове и обнажите тюбетейку.
  2. С помощью тонких ножниц с надрезом срежьте кожу над тюбетейкой и сделайте небольшие надрезы сбоку с обеих сторон у каудального/вентрального основания черепа. Сделайте дополнительные неглубокие надрезы, начиная с каудальной/дорсальной части черепа, двигаясь в ростральном направлении вверх по дорсальной средней линии, стараясь не повредить нижележащий мозг. Сделайте окончательный Т-образный срез перпендикулярно средней линии на уровне обонятельных луковиц.
    заметка: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить интересующую область (области) мозга. В частности, ни в коем случае не должно быть приложено какое-либо сжимающее усилие к самому мозгу.
  3. Используйте щипцы с круглым концом, чтобы захватить череп, начиная с рострально-медиального аспекта и отклеиваясь обратно к каудально-латеральному направлению. Повторите для обеих сторон, чтобы расколоть и удалить тыльную сторону тюбетейки, чтобы обнажить мозг. Аккуратно выньте неповрежденный мозг в стакан с предварительно охлажденным NMDG-HEPES aCSF. Дайте мозгу равномерно остыть в течение ~1 минуты.
  4. С помощью большого шпателя вытащите мозг из стакана на чашку Петри, накрытую фильтровальной бумагой. Обрежьте и заблокируйте мозг в соответствии с предпочтительным углом среза и желаемой областью мозга, представляющей интерес. Работайте быстро, чтобы избежать длительного кислородного голодания во время обработки.
    заметка: Возможно множество углов нарезки. Точный метод блокировки и угол среза будут зависеть от конкретной области мозга, типа клеток и схемы, которые будут изучаться.
  5. Прикрепите мозговой блок к держателю образца с помощью клея. Втяните внутреннюю часть держателя образца настолько, чтобы мозговой блок полностью втянулся внутрь. Налейте расплавленную агарозу прямо в держатель до тех пор, пока мозговой блок полностью не покроется агарозой. Зажмите предварительно охлажденный блок охлаждения принадлежностей вокруг держателя образца на ~10 с, пока агароза не затвердеет.
  6. Вставьте держатель образца в емкость на машине для слайсера и проверьте правильность выравнивания. Наполните резервуар оставшимся предварительно охлажденным, насыщенным кислородом NMDG-HEPES aCSF из стакана объемом 250 мл и переместите пузырьковый камень в резервуар на время нарезки, чтобы обеспечить достаточное насыщение кислородом.
  7. Отрегулируйте микрометр, чтобы начать продвижение образца мозга, встроенного в агарозу. Запустите слайсер и опытным путем отрегулируйте скорость продвижения и частоту колебаний до нужного уровня.
    заметка: Оба параметра должны быть в нижнем диапазоне. Для достижения наилучших результатов один проход рычага лезвия должен занимать около 20 с, а колебания должны производить очень плавный и мягкий гудящий шум без явного жужжания.
  8. Продолжайте продвигаться вперед и делать срез ткани с шагом 300 мкм (или другой предпочтительной толщины) до тех пор, пока интересующая область мозга не будет полностью разрезана; общее время процедуры среза должно составлять менее 15 минут.

2. Оптимизированная процедура восстановления защиты NMDG

  1. Начальная стадия восстановления NMDG (критическая стадия): По завершении процедуры секционирования соберите все срезы с помощью обрезанной пластиковой пипетки Пастера и перенесите их в предварительно нагретую (34 °C) камеру первоначального восстановления, заполненную 150 мл NMDG-HEPES aCSF. Перенесите все срезы в короткой последовательности и запустите таймер, как только все срезы будут перемещены в камеру восстановления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Компрессом VF-200Прецизионные приборыВФ-200Вибрационный тканевой слайсер (рекомендуется)
N-метил-D-глюкаминСигма ОлдричМ2004Составная часть aCSF
Хлорид натрияСигма ОлдричС3014Составная часть aCSF
Хлористый калийСигма ОлдричП5405Составная часть aCSF
Одноосновной дигидрат фосфата натрияСигма Олдрич71505Составная часть aCSF
Бикарбонат натрияСигма ОлдричС5761Составная часть aCSF
ХЕПЕССигма ОлдричН4034Составная часть aCSF
глюкозаСигма ОлдричГ7021Составная часть aCSF
Аскорбат натрияСигма ОлдричА4034Составная часть aCSF
ТиореаСигма ОлдричТ8656Составная часть aCSF
Пируват натрияСигма ОлдричП5280Составная часть aCSF
Дигидрат хлорида кальцияСигма ОлдричС7902Составная часть aCSF
Сульфат магния гептагидратСигма ОлдричМ1880Составная часть aCSF
Изогнутые тупые щипцыИнструменты для точной науки11065-07Инструменты для диссекции мозга
Тонкие ножницы для препарирования (суперрезка)Инструменты для точной науки14058-09Инструменты для диссекции мозга
Большие сверхмощные ножницы 7''Инструменты для точной науки14000-18Инструменты для диссекции мозга
Металлический шпательСигма ОлдричZ511455-1ПАКИнструменты для диссекции мозга
ЛезвияВВР89031-954Инструменты для диссекции мозга
Хранитель среза мозга-4Автоматизация научных исследованийС-БСК4Камера для удержания среза мозга
нейлоновая сеткаУорнер ИнструментсНомер 64-0198Для строительства небольших камер для извлечения ломтиков
Стеклянные стаканы Pyrex (250 мл)ВВР89090-434 (Английский)Для строительства небольших камер для извлечения ломтиков
Тарелка пластиковая 35 мм, круглаяВВР100488-376 (Английский)Для строительства небольших камер для извлечения ломтиков
Камни для газового диффузора (10 мкм)Сигма ОлдричNo 59277Для постоянной карбогенации (мелкие пузырьки)
Агароза типа I-BСигма ОлдричА0576Для встраивания образцов мозга
соляная кислотаСигма ОлдричХ1758-100МЛДля регулировки pH среды
Гидроксид натрияСигма Олдрич221465-25ГДля регулировки pH среды
едкое калиСигма Олдрич221473Для регулировки pH среды
Пластиковые переводные дозаторы 3 мл градуированныеВВР89497-676Для переноса ломтиков
Циркониевые керамические инжекторные лопастиСпециальные лезвия CadenceЭФ-ИНЗ10http://cadenceinc.com/
Водяная баня с подогревом (2,5 л)ВВР13491-060смешанный
Круги из фильтровальной бумагиВВР28456-022смешанный
Цианоакрилатный клейамазонкаB000BQRBO6смешанный
Стеклянная чашка ПетриВВР89000-326смешанный
10X Фосфатный буферный растворСигма ОлдричП5493смешанный
Термомиксер (с трубчатым блоком объемом 1,5 мл)ВВР89232-908Сохранить агарозу расплавленной

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

Похожие статьи