1. Рассечение и срез мозга
- Обезглавьте животное. С помощью скальпеля вскройте кожу на голове и обнажите тюбетейку.
- С помощью тонких ножниц с надрезом срежьте кожу над тюбетейкой и сделайте небольшие надрезы сбоку с обеих сторон у каудального/вентрального основания черепа. Сделайте дополнительные неглубокие надрезы, начиная с каудальной/дорсальной части черепа, двигаясь в ростральном направлении вверх по дорсальной средней линии, стараясь не повредить нижележащий мозг. Сделайте окончательный Т-образный срез перпендикулярно средней линии на уровне обонятельных луковиц.
заметка: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить интересующую область (области) мозга. В частности, ни в коем случае не должно быть приложено какое-либо сжимающее усилие к самому мозгу.
- Используйте щипцы с круглым концом, чтобы захватить череп, начиная с рострально-медиального аспекта и отклеиваясь обратно к каудально-латеральному направлению. Повторите для обеих сторон, чтобы расколоть и удалить тыльную сторону тюбетейки, чтобы обнажить мозг. Аккуратно выньте неповрежденный мозг в стакан с предварительно охлажденным NMDG-HEPES aCSF. Дайте мозгу равномерно остыть в течение ~1 минуты.
- С помощью большого шпателя вытащите мозг из стакана на чашку Петри, накрытую фильтровальной бумагой. Обрежьте и заблокируйте мозг в соответствии с предпочтительным углом среза и желаемой областью мозга, представляющей интерес. Работайте быстро, чтобы избежать длительного кислородного голодания во время обработки.
заметка: Возможно множество углов нарезки. Точный метод блокировки и угол среза будут зависеть от конкретной области мозга, типа клеток и схемы, которые будут изучаться.
- Прикрепите мозговой блок к держателю образца с помощью клея. Втяните внутреннюю часть держателя образца настолько, чтобы мозговой блок полностью втянулся внутрь. Налейте расплавленную агарозу прямо в держатель до тех пор, пока мозговой блок полностью не покроется агарозой. Зажмите предварительно охлажденный блок охлаждения принадлежностей вокруг держателя образца на ~10 с, пока агароза не затвердеет.
- Вставьте держатель образца в емкость на машине для слайсера и проверьте правильность выравнивания. Наполните резервуар оставшимся предварительно охлажденным, насыщенным кислородом NMDG-HEPES aCSF из стакана объемом 250 мл и переместите пузырьковый камень в резервуар на время нарезки, чтобы обеспечить достаточное насыщение кислородом.
- Отрегулируйте микрометр, чтобы начать продвижение образца мозга, встроенного в агарозу. Запустите слайсер и опытным путем отрегулируйте скорость продвижения и частоту колебаний до нужного уровня.
заметка: Оба параметра должны быть в нижнем диапазоне. Для достижения наилучших результатов один проход рычага лезвия должен занимать около 20 с, а колебания должны производить очень плавный и мягкий гудящий шум без явного жужжания.
- Продолжайте продвигаться вперед и делать срез ткани с шагом 300 мкм (или другой предпочтительной толщины) до тех пор, пока интересующая область мозга не будет полностью разрезана; общее время процедуры среза должно составлять менее 15 минут.
2. Оптимизированная процедура восстановления защиты NMDG
- Начальная стадия восстановления NMDG (критическая стадия): По завершении процедуры секционирования соберите все срезы с помощью обрезанной пластиковой пипетки Пастера и перенесите их в предварительно нагретую (34 °C) камеру первоначального восстановления, заполненную 150 мл NMDG-HEPES aCSF. Перенесите все срезы в короткой последовательности и запустите таймер, как только все срезы будут перемещены в камеру восстановления.
