Методика длительной инкубации нейронной ткани сетчатки

Аннотация

Источник: Cameron, M. A., et al. Extended Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует метод длительной инкубации нейронной ткани сетчатки. Наглазники, содержащие сетчатку, получают из мышиного глаза; внутренняя пограничная мембрана (ILM) ферментативно расщепляется для обнажения нейронных клеток сетчатки, и либо обработанный наглазник, либо изолированная сетчатка переносятся в специализированный инкубатор для длительной инкубации при низкой температуре.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Цельная подготовка сетчатки и удаление внутренней пограничной мембраны

1. Подготовьте сетчатку целиком при нормальных условиях освещения в лаборатории или при тусклом красном/инфракрасном свете.
2. Усыпить животное при вывихе шейки матки и немедленно усыпить глаза. Сделайте небольшой надрез вдоль ora пильчатой кости и поместите либо в среду Эймса, либо в искусственную спинномозговую жидкость (aCSF), содержащую (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 глюкозу, 0,5 L-глутамин и насытите карбогеном (смесь 95% O₂/5% CO₂; ~300 mOsm; pH 7,4), при комнатной температуре (RT).
3. Немедленно удалите роговицу, хрусталик и стекловидное тело, разрезав вдоль ora пильчатого зубчатого тела маленькими ножницами и сняв хрусталик и стекловидное тело щипцами. Поместите ткань в инкубационную систему по адресу RT.
   заметка: Ткань сетчатки может сохраняться в наглазнике после медленного снижения температуры до 15 - 16 °C в течение >24 ч в инкубационной системе до тех пор, пока она не понадобится.
4. Чтобы удалить ILM, перенесите наглазник, содержащий сетчатку, в небольшую стеклянную банку, содержащую 30 Ед/мл папаина, 1 мМ L-цистина, 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,005% дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в сбалансированном солевом растворе Эрла (BSS) при температуре 37 °C на 20 мин. Нанесите 95% O₂/5% CO₂ в раствор через крышку, но не пузыритесь. При использовании ткани от молодняка (<6 недели) разведите раствор до половины.
   1. Остановите ферментативное пищеварение, поместив ткань в раствор овомукоида (10 мг/мл) и бычьего сывороточного альбумина (BSA, 10 мг/мл) на 10 минут в BSS Earl's. Перед переносом в инкубационную систему тщательно промойте ткань с помощью aCSF и снизьте температуру до 15 - 16 °C.
5. Поддерживайте ткань сетчатки в наглазнике до тех пор, пока это не понадобится. Для переноса в микроскоп изолируйте сетчатку глаза от наглазника и разрежьте на 4 части лезвием бритвы. Если требуется вся сетчатка, сделайте четыре небольших разреза на периферии сетчатки, чтобы она могла лежать ровно.
   заметка: Для экспериментов с визуализацией загрузите кальциевые красители перед переносом в инкубационную систему, см. ниже.

2. Поддержание тканей в инкубаторе

1. Поместите ткань в основную камеру, содержащую зонды для измерения pH и температуры (рис. 1A, B).
2. Циркулируйте aCSF через вторую камеру (камеру UVC, построенную так, как описано выше), изолированную от основной камеры и подвергающуюся воздействию ультрафиолетового света C (UVC) мощностью 1,1 Вт (254 нм, УФ-лампа стерилизатора 5W/2P) с целью уничтожения бактерий, плавающих в растворе (рис. 1A). Управляйте синхронизацией ультрафиолетового излучения с помощью программируемого таймера с помощью случайной функции, которая включается в период от 15 до 26 минут каждые 15–30 минут, чтобы избежать чрезмерного нагрева аКСФ.
3. Установите скорость потока в камере UVC на 12 мл/мин, как сообщалось ранее. Накройте камеру UVC алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить попадание ультрафиолетового излучения за пределы камеры, которое может повредить нейронную ткань><. заметка: Для тканей сетчатки, адаптированных к темноте, наложите на основную камеру специально изготовленный чехол, чтобы исключить попадание света.
4. Используйте перистальтический насос для циркуляции раствора (aCSF) через две камеры и термоэлектрический холодный пластинчатый охладитель Пельтье для охлаждения или нагрева основной камеры до желаемых температур в диапазоне 0 - 50 °C. Для оптимальной инкубации тканей используйте температуру 15 - 16 °C для долгосрочной жизнеспособности.

Результаты

Рисунок 1. Инкубационная система, обеспечивающая жесткую регуляцию тканевой среды. A, Принципиальная схема инкубационной системы, состоящей из охлаждающей пластины Пельтье, основной камеры, перистальтического насоса и камеры UVC. B, Вид сбоку на главную камеру, показывающий точки впуска и выхода аКСФ, а также вход карбогена, датчики температуры и pH. Ткань укладывается на сетку в соо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид натрия	Сигма Олдрич ВЕТЭК	V800372
Хлористый калий	Сигма Олдрич	П9333
N-метил-D-глюкамин	Сигма Олдрич	М2004
D-глюкоза	Сигма Олдрич	Г5767
Бикарбонат натрия	Сигма Олдрич	С6014
Хлорид магния	Сигма Олдрич	М9272
Хлорид кальция	Сигма Олдрич	223506
Система диссоциации папаина	Уортингтон	LK003150
Вертикальный микроскоп с фиксированным столиком	Олимп	BX51WI
микрообъектив	Олимп	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	В 20 раз
микрообъектив	Олимп	LUMPlanFLN 60x/1.00w	В 60 раз
Брейнкубор	Пайо Сайентифик	BR26021976	www.braincubator.com.au
Термоэлектрический охладитель холодной пластины Пельтье	Технология TE	СР-121
Регулятор температуры	Технология TE	ТК-36-25 РС232