1. Подготовка материалов и питательных сред
- Для рассечения и диссоциации ЗКН (субкаллозальной зоны) оберните мозговой матрикс, обоюдоострое бритвенное лезвие и щипцы алюминиевой фольгой, а затем простерилизуйте их путем автоклавирования.
- Приготовьте 50 мл холодного буфера PBS (фосфатно-солевой буфер) для промывания всего мозга мыши.
- Установите диссекционный микроскоп и подготовьте хирургические инструменты, необходимые для вскрытия мозга (автоклавные ножницы и щипцы) и изоляции ЗКН (шприц 1 мл, игла 30 G, матрикс мозга и тонкие щипцы).
- Приготовление среды N2:
- Приготовьте среду F-12/DMEM (+L-глутамин, + бикарбонат натрия) с 2% B27, 1% N2 добавок и 1% пенициллин-стрептомицина.
Примечание: Питательная среда состоит из среды N2 и факторов роста (20 нг/мл очищенного эпидермального фактора роста (EGF) и 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF2)).
- Приготовьте буфер для пищеварения (40 ЕД/мл папаина, 2,4 ЕД/мл диспаза II и 2% пенициллин-стрептомицин в PBS) для переваривания тканей.
- Подготовка пластины покрытия и покровного стекла:
- Получают поли-L-орнитин (PLO; 0,01%) и ламинин (10 мкг/мл растворенные в DH2O). Чтобы покрыть 6-луночные планшеты для поддержания SCZ-aNSCs (взрослых нейральных стволовых клеток) в виде монослоя или покровных стекол 18 мм для иммуноокрашивания, инкубируйте их с PLO в течение ночи при 4°C. Затем вымойте их 3 раза с DH2O. Дайте пластинам и покровным стеклам высохнуть после последней стирки.
- Далее инкубируйте планшеты с ламинином в течение ночи при температуре 4 °C. Затем промойте их 3 раза с DH2O.
Внимание: Не высушивайте ламинин, так как это повлияет на прикрепление клеток.
Примечание: Растворы покрытий можно использовать повторно 3 раза.
2. Изоляция и диссоциация взрослого ЗКН
- Перед приготовлением культуры поместите матрикс мозга и обоюдоострую бритву на лед.
Примечание: Не замораживайте мозговую матрицу, потому что мозг может прикрепиться к ней.
- Принесите в жертву мышь (в возрасте 8 недель) путем удушьяСО2 или вывиха шейки матки.
- Отрежьте голову острыми ножницами после распыления 70% этанола. Чтобы обездвижить голову, крепко держите обе стороны головы. Разрежьте кожу ножницами по средней линии в каудально-ростральном направлении. Это способствует полному удалению кожи с черепа.
- Сначала удалите каудальную часть черепа (заднюю от лямбды), а затем вставьте щипцы между черепом и мозгом в положении дорсальной средней линии. Возьмите левую (или правую) теменную кость и осторожно снимите ее. Повторите эту процедуру для удаления другой теменной кости.
Примечание: Отсоединение зрительного нерва и удаление мозговых оболочек от мозга облегчает отделение мозга от черепа.
- Переведите мозг в холодный буфер PBS (25 мл) и дважды промойте его, чтобы удалить лишнюю кровь.
- Поместите мозг в матрикс мозга на льду и сделайте корональные надрезы, чтобы получить срезы толщиной 1 мм. Перенесите срезы мозга (1 мм), содержащие участки ЗКН, расположенные в задней части мозга, в холодный PBS в пластиковой чашке Петри диаметром 35 мм.
осторожность: Для того чтобы получить параллельную плоскость корональных сечений, убедитесь, что мозговая щель расположена по средней линии мозгового матрикса; Очень важно избегать ненужных изменений в разделах.
заметка: Получить срезы мозга на расстоянии 2-3 мм позади брегмы; это позволяет отделить ЗКН от СВЗ (субвентрикулярной зоны).
- Под рассекающим микроскопом с малым увеличением микроскопом микродиссекцию ЗКН из области белого вещества коры и гиппокампа с помощью изогнутой иглы 30G6,9. Затем удалите участки коры головного мозга над ЗКН. Рассеченную область ЗКН из ломтиков поместить в пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм на льду без холодного PBS.
заметка: Контаминация дополнительных областей, содержащих зрелые нейроны, может повлиять на жизнеспособность аНСК и формирование нейросферы, поскольку они подвергаются клеточной гибели в условиях культивирования аНСК.
- С помощью согнутой иглы 30 г сразу же измельчите рассеченные ткани на мелкие кусочки.
заметка: Если для рассечения ткани ЗКН требуется более длительное время, перед измельчением погрузите рассеченные ткани в холодный ПБС.
- Повторно суспензируйте измельченную ткань с 1 мл буфера для пищеварения, перенесите ткань в пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл буфера для пищеварения, и инкубируйте ее в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37°C><.
заметка: Встряхивайте тюбик каждые 10 минут, чтобы хорошо перемешать.
3. Культура взрослого нервного стволового клетки, полученная из субкаллозальной зоны
- Слегка постучите по пробирке, чтобы диссоциировать переваренную ткань, а затем центрифугируйте пробирку при давлении 145 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспензируйте переваренную ткань 1 мл предварительно подогретой среды N2, чтобы смыть буфер для сбраживания, и осторожно нанесите раствор образца не более 5 раз с помощью пипетки P100><0.
заметка: Чрезмерное растирание с узким кончиком пипетки может привести к снижению жизнеспособности клеток и последующему росту.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 145 x g в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды N2.
- Приготовьте 1 мл среды N2 в 6-луночной пластине без оболочки и добавьте 1 мл взвешенных клеток, чтобы получить окончательный объем 2 мл.
- Добавьте EGF (20 нг/мл) и bFGF (20 нг/мл) в каждую лунку. Осторожно встряхните чашку для 6-луночных культур вручную, чтобы смешать добавленные факторы роста с пластинчатыми клетками. Держите 6-луночный планшет в инкубаторе с температурой 37°C и 5%CO2.
- Добавляйте EGF (20 нг/мл) и bFGF (20 нг/мл) в каждую лунку каждый день в течение 8 дней. Каждые три дня добавляйте 200 мкл среды N2, чтобы сохранить примерно 2 мл объема среды.
4. Пассирование НСК в виде нейросфер и в монослойные культуры
- Соберите нейросферы и перенесите их в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
Примечание: Количество нейросфер (>50 мкм в диаметре) на лунку из ЗКН мозга одной мыши составило 64,3 ± 7,31, что меньше, чем у СЗЗ (190,5 ± 6,33).
- Инкубируйте нейросферы с 0,5 мл диссоциативного буфера в течение 5 минут на водяной бане при температуре 37°C для диссоциации нейросфер на отдельные клетки. Первичные нейросферы могут быть диссоциированы на отдельные клетки и поддерживаться в течение нескольких проходов в виде нейросфер или монослойных культур.
заметка: Расширение SCZ-aNSCs в качестве монослоя превосходит нейросферы><, поскольку SCZ-aNSCs могут проходить >10 раз в формате монослойной культуры и <5 раза в формате культуры нейросферы.
осторожность: SCZ-aNSCs демонстрируют сильную агрегацию, и их трудно диссоциировать на отдельные клетки. Таким образом, формат нейросферной культуры не рекомендуется для рутинной экспансии клеток.
- Осторожно дозируйте раствор образца вверх и вниз с помощью пипетки P1000 менее 5 раз и центрифугируйте пробирку при 145 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте нейросферы 1 мл среды N2.
заметка: Чрезмерное титурирование с помощью узкого кончика пипетки может снизить жизнеспособность клеток и последующий рост.
- Для подсчета клеток необходимо сделать смесь клеточной суспензии (10 мкл) и 0,4% раствора трипанового синего в соотношении 1:1, а затем подсчитать количество живых клеток на гематоцитометре. После покрытия 6-луночного планшета PLO/ламинином, обработайте клетки в концентрации 2,5 x 105 клеток/мл 2 мл среды N2 для каждой лунки><.
заметка: Изменения плотности клеток могут влиять на их состояние и потенциал дифференцировки.
- Поддерживайте ЗКН-аНСК с ежедневной обработкой факторами роста (2 мл, 20 нг/мл) в течение 5 дней, а затем проведите их.
5. Дифференцировка взрослых нервных стволовых клеток взрослого организма, происходящих из субкаллозальной зоны
- Пластину aNSCs наносят на покровное стекло 18 мм, покрытое PLO/Laminin, с концентрацией 1 x 105 клеток/мл в 1 мл N2 с факторами роста (20 нг/мл) для дифференцировки SCZ-aNSCs.
- На следующий день, когда клетки прочно прикрепятся к покровному листу, замените питательную среду N2 для удаления факторов роста.
- Через 6 дней промойте дифференцированные клетки 1 мл PBS для удаления клеточных остатков и фиксации их для иммуноокрашивания.
Примечание: BrdU может быть включен во вновь синтезированную ДНК пролиферирующих клеток. Поэтому при желании BrdU (10 мкг/мл) можно добавлять в живые клетки перед фиксацией клеток.
