Создание ко-культуры клеток пульпы зуба и нейронов тройничного нерва для перекрестной коммуникации

Аннотация

Источник: Barkley, C. et al., Метод совместного культивирования для изучения роста нейритов в ответ на паракринные сигналы пульпы зуба.J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует технику создания совместной культуры нейронов тройничного нерва и первичных клеток пульпы зуба с использованием трансвелл-фильтра. В этом физически разделенном состоянии мезенхимальные клетки, полученные из ткани пульпы зуба, секретируют паракринные сигнальные молекулы, которые проходят через поры, способствуя дифференцировке и миграции нейронов к мезенхимальным клеткам, создавая систему совместного культивирования.

Протокол

1. Подготовка тарелок

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крышка планшета закрыта во время всех этапов инкубации и промывки за пределами колпака для культуры стерильных тканей, чтобы предотвратить загрязнение во время обработки образца.

1. Фильтры для покрытий
   1. Развести ламинин до 10 мкг/мл. Разведенный ламинин процеживаем под капот.
   2. Пипетка 450-500 мкл 10 мкг/мл ламинина в каждую лунку 24-луночного планшета.
   3. Поместите фильтр с пористостью 3 мкм в лунку так, чтобы он контактировал с раствором ламинина, и оставьте его в инкубаторе при температуре 37 °C на 2 часа или на ночь. Поры фильтра должны позволять некоторой части раствора диффундировать и покрывать как верхнюю, так и нижнюю часть фильтра. Эти фильтры следует использовать в течение 48 часов или хранить в холодильнике при температуре 4 °C в течение 1 недели.

2. Покрытие ячеек

1. Мыши: Генетическое изменение клеток пульпы зуба (ДП) может быть выполнено (но не обязательно) для изучения мезенхимально-нейронных взаимодействий.
2. Рассечение, диспергирование и гальванизация DP (рис. 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для диссекции DP используйте ультратонкие щипцы с прямыми краями. Ультратонкие края позволят пользователю вклинить край щипцов между минерализованной структурой и тканью DP.
   1. Соберите урожай у мышей Р5-П8. На этом этапе зубчики должны быть минерализованными, а корень открытым.
   2. Обезболите новорожденных с помощью гипотермии, поместив их в посуду в холодильнике при температуре 4 °C до тех пор, пока они не перестанут двигаться или реагировать на прикосновения. Усыпляйте новорожденных путем обезглавливания и в соответствии с процедурами Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в назначенном учреждении.
   3. Приготовьте 3-5 мл аликвоты 0,25% трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) в конической пробирке объемом 50 мл для сбора ДП от каждой мыши. Это облегчит переваривание пульпы зуба от постнатальных мышей. Используйте более 3 мл при переваривании тканей более чем 10 постнатальных мышей.
   4. Положите голову на одноразовую пеленку так, чтобы рот был направлен к потолку, а основание шеи было ровно на рабочей поверхности. Используйте лезвие бритвы в пилящем движении, чтобы отделить нижнюю челюсть от верхней челюсти.
   5. По желанию удалите язык ножницами или щипцами, чтобы облегчить доступ к коренным зубам.
   6. Поместите открытую головку в чашку на стерильную марлевую салфетку и поместите образец под препарирующий микроскоп (рисунок 1D).
   7. Удалите альвеолярную костную ткань, окружающую первые моляры. Подчелюстные зубы к этому моменту прорезываются не полностью. Вставьте щипцы в альвеолярное отверстие и дразните ткань от зуба к щечной (щечной) или язычной (язык) стороне рта. Верхнечелюстные зубы потребуют полного удаления щели вокруг зуба для обнажения и удаления.
   8. Аккуратно перенесите подчелюстные и верхнечелюстные первые моляры (M1s) в отдельную чашку для клеточной культуры с 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
   9. Повторяйте пункты 2.2.4-2.2.8, пока не будут собраны все M1. Держите посуду с M1 на льду во время сбора урожая.
   10. Удалите наружный орган эмали (EOE), окружающий внешнюю сторону каждого M1. В качестве альтернативы это можно сделать после шага 2.2.11.
   11. С помощью набора щипцов поверните M1 так, чтобы бугорки были опущены, а открытый корень был открыт. В нижней части зуба будет овальное отверстие, а также непрозрачная ткань DP, инкапсулированная тонким слоем дентина и эмали.
   12. С помощью кончика щипцов осторожно ослабьте DP, проведя одной рукой щипцов по внутренней окружности минерализованной ткани. Удалите ткань DP из минерализованной структуры и перенесите ее в третью чашку, содержащую 1x PBS. Удалите ЭОЭ, если он еще не был отделен (рисунок 1E).
   13. Переведите всю ткань DP в 0,25% трипсин-ЭДТА в коническую пробирку объемом 50 мл. Перемешайте смесь и поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 10 минут. Это можно сделать с помощью тех же щипцов или с помощью длинных щипцов в виде флакона. Ткань будет с трудом разгоняться и потребует вортексирования каждые 3-4 минуты. НЕ ПРЕВЫШАЙТЕ 10 минут трипсинизации, так как трипсин может повредить клеточные мембраны.
   14. Под стерильным колпаком добавьте подогретую среду для совместного культивирования (Таблица 1) до конечного соотношения не менее 1:1 к трипсину для инактивации фермента. Более высокие соотношения приемлемы, если требуется большая дисперсия в тканях.
   15. Пипетируйте среду вверх и вниз несколько раз с помощью пипетки объемом 10 мл, чтобы еще больше диспергировать DP в среде. Будьте осторожны, чтобы не допустить появления крупных пузырей. Полное диспергирование практически невозможно из-за липкой природы ткани. Однако в этом также нет необходимости, поскольку клетки будут мигрировать наружу из ткани после наложения пластин.
   16. Перенесите 1 мл диспергированного DP в каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей (рис. 1F).
   17. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и дайте клеткам прикрепиться и мигрировать из недиспергированной ткани в течение 48 часов, прежде чем менять среду. Первичные клетки должны быть покрыты в относительно высоких концентрациях, чтобы достичь 85-90% слияния в течение 1 недели. Если это не достигнуто через 1 неделю, выбросьте тарелку.
3. Диссекция, дисперсия и осаждение нейронов тройничного нерва
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе визуализация роста нейритов в кокультуре с клетками DP была оптимизирована с использованием подростка (6 недель) B6. Мыши Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J. Центральная и периферическая нервная системы мышей Thy1-YFP имеют метку желтого флуоресцентного белка (YFP), экспрессия которой начинается около P6-P10 в нейронах и экспоненциально увеличивается по всей нервной системе в течение постнатальной и взрослой жизни. YFP и GFP имеют консервативные последовательности, которые позволяют окрашивать эти нервы анти-GFP антителами, что приводит к паннейрональному окрашиванию. В конечном счете, эти мыши позволяют лучше визуализировать и количественно оценить нейроны, используемые и выращенные в клеточной культуре.       
   1. Усыпляйте мышей-подростков углекислым газом с последующим вывихом шейки матки.
   2. Обезглавите мышей и снимите кожу с черепа. Обязательно включите равное количество самцов и самок.
   3. Вставьте кончик ножниц для микрорассечения в основание черепа. Разрежьте вдоль сагиттального шва черепа (рисунок 1А).
   4. Сделайте четыре небольших горизонтальных разреза: два вдоль коронарных швов у ушей, и два вдоль лямбдоидных швов у основания черепа. При этом должно получиться два лоскута кости.
   5. С помощью щипцов отклейте два лоскута кости. При этом должен быть раскрыт мозг.
   6. Удалите мозг. Перенесите голову в чашку для культуры тканей с 1x PBS и поместите под микроскоп.
   7. Найдите ганглии тройничного нерва (ТГ), которые хорошо заметны у грызунов¹³ и расположены в твердой мозговой оболочке между мозгом и костью верхнечелюстного отростка (рис. 1B).
   8. Отрежьте три ветви, которые идут к глазам, верхней и нижней челюстям, и перенесите ганглии в холодный 1x PBS с помощью тонких щипцов с прямым краем. Держите блюдо, содержащее ганглии TG, на льду во время сбора урожая.
   9. После того, как все пучки ТГ будут собраны, перенесите ганглии в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую стерильно отфильтрованную коллагеназу II типа 5 мг/мл с помощью щипцов флакона.
   10. Вортексируйте коллагеназу с помощью пучка TG и поместите пробирку в водяную баню при температуре 37 °C на 25-30 минут. За это время выньте коническую трубку из водяной бани, вортекс, и возвращайтесь в ванну каждые 5-10 минут.
   11. Центрифугируйте раствор нейрона коллагеназы-ТГ в течение 2 мин при 643 x g.
   12. Под капюшоном для культуры тканей аккуратно аспирируйте коллагеназу с помощью микропипетки.
   13. Добавьте 5 мл 1% стерильно отфильтрованного трипсина типа II и вортекс. Поместите коническую трубку на водяную баню при температуре 37 °C на 5 минут.
   14. Центрифугируйте смесь трипсин-ТГ в течение 5 минут при 643 x g. Удалите верхнюю часть трипсина с помощью микропипетки, чтобы не были удалены нейроны ТГ. В трубке все равно останется жидкость.
   15. Добавьте достаточное количество среды, чтобы деактивировать оставшийся трипсин (в соотношении трипсина к среде 1:1 или ниже).
   16. Подсчитайте количество клеток и разбавьте раствор до 200 000 клеток/мл (250 мкл клеток, содержащих 50 000 клеток).
   17. Поместите транслуночные фильтры с покрытием из секции 1.2 в лунки с DP.
   18. Разбавьте раствор, содержащий клетки, так, чтобы получилось 200 000 клеток/мл. Нанесите пипетку объемом 250 мкл на трансвеллерный фильтр и культивируйте клетки при температуре 37 °C в течение ночи (рис. 1F).
   19. На следующий день замените среду 1 мл среды для совместной культуры с 1 мкМ уридином и 15 мкМ 5'-фтор-2 дезоксиуридина, чтобы остановить чрезмерную пролиферацию мезенхимальных клеток, которая может предотвратить рост нейритов. Необязательно: Добавьте факторы роста или ингибиторы в эту среду при попытке дальнейших манипуляций.

Таблица 1: Медиа совместной культуры.

компонент	том	концентрация
MEM α	440 мл
Подогреть инактивированную фетальную бычью сыворотку	50 мл	10%
100x L-глутамин	5 мл	1x
Пенициллин-стрептомицин 100 х	5 мл	1x
Смените среду на 2-й день с митотическими ингибиторами в этих конечных концентрациях
Уридин		1 мкМ
5'-фтор-2'дезоксиуридин		15 мкМ

Результаты

Рисунок 1: Схема вскрытия мышей для получения клеток для совместного культивирования.(А) Схема, показывающая, где нужно разрезать, чтобы вскрыть череп мыши и локализовать нервы ТГ, показанная черным цветом на последнем изображении. Ножницы указывают, куда вставлять кончики ножниц для резки по пунктирным линиям. (B) Комбинированное изображение в темном поле и GFP, пок...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-фтор-2'-дезоксиуридин	Сигма-Олдрич	Ф0503	Используется в качестве ингибитора митоза в концентрации 15 мкМ в средах совместного культивирования, день 2
24-луночный планшет для культивирования клеток	Корнинг	No 3524	Планшет для совместной культуры
В6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	Лаборатория Джексона	12603	Модель мыши Tgfbr2f/f используется для клеток пульпы зуба в оптимизированном протоколе
В6. Cg-TG(Thy1-YFP)16Jrs/J	Лаборатория Джексона	No 3709	Модельный генотип мышей Thy1-YFP для нейронов тройничного нерва
Коллагеназа II типа	Многородность	234155-100МГ	Используется для диспергирования нейронов тройничного нерва
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	No 10437	Аддитивный к медиа совместной культуры
Тонкие щипцы	Инструменты для точной науки	11413-11	Тонкие щипцы для диссекции ТГ
Ламинин	Сигма-Олдрич	Л2020	Покрывает вкладыши трансвелла в конечной концентрации 10 мкг/мл, исходный раствор принимается в дозе 1,5 мг/мл
L-глютамин	Gibco	25030081	Аддитивный к медиа совместной культуры
Ножницы для микрорассечения	Сигма-Олдрич	С3146-1ЭА	Ножницы для вскрытия черепа
Минимальные основные средства массовой информации	Gibco	12571063	Медиабаза кокультуры
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15070063	Добавка антибиотика в среды совместного культивирования
Ингибитор фосфатазы	Сигма-Олдрич	04 906 837 001	Добавка к буферу RIPA для извлечения белка из клеток пульпы зуба после кокультуры
Вкладыш для клеточных культур ThinCert	Greiner Bio-One	662631	Вставки Transwell для нейронов тройничного нерва в анализах кокультуры
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200056	Используется для диспергирования клеток пульпы зуба
Трипсин II типа	Сигма-Олдрич	Т-7409	Используется для диспергирования нейронов тройничного нерва
Ультратонкие щипцы	Инструменты для точной науки	11370-40	Ультратонкие щипцы для рассечения
Уридин	Сигма-Олдрич	У3750	Используется в качестве ингибитора митотики в концентрации 1 мкМ в средах совместного культивирования, день 2
Щипцы для флаконов	Инструменты для точной науки	110006-15	Длинные щипцы для переноса тканей в конические