1. Культивирование и хранение перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека
- Поддерживайте перивентрикулярные эндотелиальные клетки человека на базальной мембране, покрытой матричным покрытием (см. Таблицу материалов) 6-луночных планшетах в перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среде (среда Е6, содержащая 50 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов A [VEGF-A], 100 нг/мл фактора роста фибробластов 2 [FGF2] и 5 мкМ гамма-аминомасляной кислоты [ГАМК]) при 37 °C и 5%CO2. Меняйте носитель через день.
- Разморозьте матрицу базальной мембраны при 4 °C и приготовьте раствор в соотношении 1:100, разбавив его в холодной модифицированной среде Dulbecco Eagle medium/biotrient mix F-12 (DMEM/F12). Смажьте каждую лунку 6-луночного планшета 1 мл матричного раствора. Перед использованием инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 1 часа.
- Позволяют перивентрикулярным эндотелиальным клеткам человека достигать конфлюенции 80%-90%. Аспирация среды из скважины. Промойте лунки один раз 1 мл стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) на лунку.
- Отделите клетки, добавив 1 мл раствора для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) на лунку. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут. Через 5 минут добавьте 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды. Перелейте раствор клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
заметка: Здесь мы используем Accutase для диссоциации клеток, в отличие от TrypLE в разделах 3 и 4.
- Центрифугируют клетки при давлении 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, отсасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды.
- Подсчитайте живые клетки методом исключения трипанового синего. Затравочные клетки в пластинах, покрытых свежей матрицей, плотностью 1,2 х 105 клеток/см2. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2.
- Хранение перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека путем криоконсервирования в замораживающей среде (90% перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды и 10% диметилсульфоксида [ДМСО]).
- Диссоциируйте и соберите клетки, следуя шагам 1.3 и 1.4 выше. Подсчитайте ячейки в растворе методом исключения трипанового синего.
- Центрифугируйте ячейки при давлении 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в концентрации 5 x 106 клеток/мл замораживающей среды.
- Выдайте 1 мл замораживающей среды плюс клетки на криовиал. Поместите флаконы в камеру, наполненную изопропанолом, и охладите в течение ночи до -80 °C при 1 °C/мин. На следующий день переложите флаконы в емкость с жидким азотом для длительного хранения.
2. Подготовка перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека к анализу
- Позволяют перивентрикулярным эндотелиальным клеткам человека достигать 70%-80% конфлюенции.
- Диссоциируйте клетки, выполнив шаги с 1.3 по 1.5, как описано выше. Подсчитайте ячейки с помощью метода исключения трипанового синего.
3. Подготовка ГАМКергических интернейронов человека к анализу
ПРИМЕЧАНИЕ: ГАМКергические интернейроны, полученные из индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками человека (iPSC), и нейронная среда были коммерчески приобретены (см. Таблицу материалов). Нейроны генерируются путем дифференцировки линии iPSC, полученной из фибробластов человека, в соответствии с протоколом, разработанным производителем. Клетки размораживали и культивировали в соответствии с протоколом производителя.
- Разморозьте человеческие ГАМКергические интернейроны и культивируйте их в 12-луночном планшете в течение двух недель до слияния 70%-80%.
- В день проведения анализа раствор для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) и аликвоту нейронной среды при температуре 37 °С в течение 10 мин перед применением.
- Асасируйте среду из каждой лунки, содержащей клетки. Промойте ячейки 1 мл стерильного 1x PBS на лунку.
- Отделите клетки, добавив 0,5 мл предварительно подогретого раствора диссоциации на лунку, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин. Добавьте 1 мл нейрональной среды на лунку. Переведите раствор ячейки в коническую пробирку объемом 15 мл. Аккуратно растирайте, чтобы диссоциировать клеточные комки.
- Центрифугируйте клетки при давлении 380 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл нейронной среды. Подсчитайте живые клетки методом исключения трипанового синего.
4. Подготовка контрольных эндотелиальных клеток человека к анализу
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные эндотелиальные клетки человека, полученные из iPSC, и среда эндотелиальных клеток были коммерчески приобретены (Таблица материалов). Эти эндотелиальные клетки образуются путем дифференцировки линии iPSC, полученной из фибробластов человека, в соответствии с эндотелиальной судьбой в соответствии с протоколом, разработанным производителем. Клетки размораживали и культивировали на субстрате фибронектина в соответствии с протоколом производителя. Пластины, покрытые фибронектином, были изготовлены в соответствии с протоколом производителя.
- Размораживание контролирует эндотелиальные клетки человека и культивирует их в 6-луночных планшетах до конфлюенции 80%-90%.
- В день проведения анализа раствор для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) и аликвоту эндотелиальной среды при температуре 37 °С в течение 10 мин перед применением.
- Отсасывайте среду из каждой лунки, содержащей клетки. Промойте ячейки 1 мл стерильного 1x PBS на лунку.
- Отделите ячейки, добавив 0,5 мл предварительно подогретого диссоциационного раствора на лунку. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавьте 1 мл среды эндотелиальных клеток на лунку, чтобы нейтрализовать раствор диссоциации. Переведите раствор ячейки в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте ячейки при плотности 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспиратируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл эндотелиальной клеточной среды. Подсчитайте живые клетки методом исключения трипанового синего.
5. Приготовление однолуночных культуральных вставок
- Раствор ламинина 1 мг/мл разморозить при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.
- Смажьте соответствующее количество посуды 35 мм 0,01% раствором поли-L-орнитина (1 мл на посуду). Выдерживайте посуду при комнатной температуре не менее 1 ч.
- Раствор ламинина 1:300 развести в стерильной воде до конечной концентрации 3,3 г/мл непосредственно перед применением.
- Полностью аспирируйте поли-L-орнитин из каждого блюда. Тщательно промойте каждую посуду 3 раза стерильной водой и полностью аспирируйте, чтобы избежать токсичности клеток, вызванной поли-L-орнитином.
- Добавьте 1 мл 3,3 мкг/мл раствора ламинина в каждую посуду и выдерживайте при 37 °C в течение ночи или не менее 1 ч. Удалите раствор ламинина из посуды непосредственно перед использованием.
заметка: В качестве альтернативы храните чашки, содержащие ламинин, при температуре 4 °C. Перед использованием уравновесьте чашки в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C.
- Разрежьте с трех сторон одну лунку двухлуночной силиконовой вставки для культуры (Рисунок 1A) с помощью стерильного лезвия, чтобы получить однолуночную вставку (Рисунок 1B).
заметка: Держите вкладыш с двумя лунками надежно прикрепленным к поверхности оригинальной упаковки во время резки, чтобы обеспечить ровный срез и сохранить адгезию вкладыша.
- Аспират раствор ламинина из посуды.
заметка: Не мойте посуду стерильным PBS или водой после инкубации ламинина. Влажные поверхности предотвратят плотное сцепление вставки с культурой.
- Снимите однолуночный вкладыш стерильным пинцетом и поместите его в центр чашки, покрытой поли-L-орнитином/ламинином. Надавите по краям вставки, чтобы зафиксировать ее на поверхности блюда.
- Осторожно переверните блюдо вверх дном, чтобы убедиться в прочном прилегании вставки.
- Держите тарелку вверх дном и отметьте границу отсека для вкладышей перманентным черным маркером с ультратонким кончиком (рисунок 1C).
6. Анализ миграции кокультур
- Ко-суспензия 3 x 104 ГАМКергических интернейрона и 3 x 104 перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека в 70 мкл сокультуральной среды (50% перивентрикулярной поддерживающей среды без ГАМК и 50% нейрональной среды). Засейте раствор этой ячейки внутрь отсека с однолуночной вставкой. Приготовьте соответствующее количество таких блюд для анализа.
заметка: ГАМК не добавляли в среду для совместного культивирования, чтобы исключить влияние экзогенной ГАМК на миграцию.
- Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что элементы не вытекают из отсека для вставки.
- Медленно добавьте 1 мл среды для совместной культуры вдоль стенки формы, чтобы предотвратить высыхание покрытия.
заметка: Медленно добавляйте медиум по краю блюда, чтобы вставка не была нарушена.
- В качестве первого контроля засейте 3 x 10 4 человеческих ГАМКергических интернейрона только в 70 мкл среды для совместного культивирования на одну лунку. Приготовьте соответствующее количество таких блюд.
- В качестве второго контроля засейте 3 x 104 ГАМКергических интернейронов человека с 3 x 104 контрольными эндотелиальными клетками человека в 70 мкл среды для совместного культивирования на одну лунку. Приготовьте соответствующее количество блюд.
- Инкубируйте чашки в течение 24 часов при 37 °C и 5%CO2. После 24-часовой инкубации проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикрепились правильно и нет утечки.
- Через 48 часов после посева аккуратно снимите вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клеточный слой не нарушен (день 0).
- Удалите среду и добавьте 1 мл свежей среды для совместного культивирования.
заметка: Выделите соответствующее количество блюд для получения изображений дня 0.
- Инкубируйте клетки в течение 5 дней при 37 °C и 5% CO2.
