Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Нанесение срезов на вставки
- Заполните каждую лунку 6-луночного планшета 1 200 μл среды для срезов. Заполните все неиспользуемые лунки 1 200 μл PBS и заполните центральное пространство пластины 5 мл 1x PBS. Храните эту тарелку при температуре 37 °C.
- С помощью шумовочной ложки поместите ломтик мозга в носитель на вкладыше, осторожно надавливая на ломтик, чтобы полностью погрузить его в воду. Повторите для всех ломтиков.
- С помощью p1000 вытяните 1 мл питательной среды для срезов из верхней части вкладыша и распределите его на дно лунки. Удалите и выбросьте излишки среды до тех пор, пока края агарозы вокруг среза мозга не станут видны. Проделайте это для оставшихся ломтиков.
- Возьмите вставку за ободок с помощью щипцов, наклоните и удалите излишки среды. Затем быстро переложите вкладыш в чашку диаметром 35мм2, содержащую 1 мл питательной среды для слайсов. Используйте 2 пары острых щипцов для удаления агарозы вокруг ткани, стараясь не растянуть/не повредить, не разрезать и не проткнуть отверстие в мембране (проще всего, если вы сделаете разрыв на самом краю агарозы, а затем раздвинете агарозу с любой стороны). Затем переместите вставку обратно на 6-луночную пластину и повторите то же самое для оставшихся ломтиков.
- В вытяжке для тканевых культур при выключенной воздуходувке (чтобы предотвратить высыхание срезов) удалите фрагменты агарозы с каждой мембраны.
- Переложите ломтики в 6-луночную тарелку, приготовленную на шаге 1.1, и храните тарелку при температуре 37 °C. Выдерживайте ломтики в течение 24-48 часов.
2. Изменение среды культуры слайса
- Повторите шаг 1.1 со свежей 6-луночной пластиной.
- В вытяжке для тканевых культур с выключенной воздуходувкой перенесите вкладыши в новые 6-луночные планшеты, содержащие свежую среду для срезов.
3. Нанесение опухолевых клеток на срез
- Обработайте ультразвуком краситель Cm-DiI и отжимайте на средней скорости в течение 2 минут.
- Вращайте опухолевые клетки, используемые для наложения, при давлении 201 x g в течение 5 минут. Затем повторно суспендируйте в 2 мл среды для срезов культуры.
- Добавьте 7 μл Cm-DiI в 2 мл клеток и сред и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут.
- Понизьте температуру ячеек при 201 x g в течение 5 минут и снова суспендируйте в 200 мкл среды для нарезки. Осторожно растирайте для диссоциации клеток (10-20 раз или пока гранула не исчезнет), а затем добавьте 800 μl среды для нарезки, чтобы получить общий объем 1 000 μl.
- Подсчитайте жизнеспособные опухолевые клетки с помощью трипанового синего. Добавляйте в опухолевые клетки зеленые флуоресцентные микросферы в той же концентрации, что и клетки. Эти инертные микросферы будут служить в качестве контроля. Уменьшите клеточно-микросферическую смесь при 201 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте в желаемом количестве среды для срезов культуры. Пластинчатые ячейки с плотностью 6 000 клеток/срез в объеме 65 μл. Количество ячеек, покрываемых на срезе, может быть увеличено в зависимости от предпочтений и доступности.
- В вытяжке для культуры тканей распределите клетки по 65 мкл среды/среза в центр среза.
