$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка МПС
Примечание: MEA состоят из стеклянной подложки, микроизготовленных металлических электродов и полимерного изоляционного слоя SU-8. Для целей данного исследования были заказаны коммерчески доступные МЭА с индивидуальной компоновкой электродной матрицы (рис. 1 A&B). 68 электродов расположены в виде прямоугольной сетки, разделенной на две зоны канавкой шириной 300 мкм, свободной от электродов, электрических проводов и изоляции. Каждый электрод имеет размер 40 х 40 мкм, и они расположены на расстоянии 200 мкм друг от друга от центра к центру. Четыре больших заземляющих электрода расположены вокруг места записи. Они отличаются от других коммерчески доступных стандартных MEA своими размерами (21 мм x 21 мм) и не имеют фиксированной записывающей камеры.
- Для дезинфекции промойте MEA в 100% этаноле (2x), 70% этаноле (1x) и дистиллированной воде (2x) в течение не менее 30 секунд каждый. Дайте высохнуть. Положите 10 - 12 MEA в чистую стеклянную чашку Петри (150 мм x 25 мм) и закройте крышкой.
- Автоклав MEA в течение 20 мин при 120 °C. Хранить при RT.
- Приготовьте раствор для покрытия (см. список материалов) для МЭА и храните аликвоты при температуре -20 °C.
- Поместите каждый MEA в индивидуальную стерильную чашку Петри (35 мм x 10 мм).
- С помощью охлажденной пипетки налейте 150 мкл охлажденного раствора покрытия на электроды и закройте крышку чашки Петри. Примерно через 10 минут проверьте наличие пузырьков воздуха на верхней части электродов и при необходимости аккуратно удалите их резиновым шпателем. Дайте отдохнуть в течение 1 часа при комнатной температуре (RT).
- Остатки аспиратного покрытия, промыть 1 раз средой, оптимизированной для пренатальных и эмбриональных нейронов, и 2 раза дистиллированной стерильной водой. Если МЭА не используются до следующего дня, храните их в дистиллированной стерильной воде при температуре 37 °C в инкубаторе в течение ночи (О/Н). В противном случае дайте прямо высохнуть при RT.
2. Ингредиенты, необходимые для приготовления и выращивания органотипических культур
- Приготовьте моющий раствор без кальция (см. список материалов).
- Восстановите куриную плазму в промывочном растворе (1:1, осторожно встряхните, не допуская образования пузырьков), центрифугируйте при 3000 x g в течение примерно 20 минут и сцедите прозрачное содержимое в стерильную пробирку. Аликвот 200 мкл в криопробирки и хранить при температуре -20 °C.
- Восстановите тромбин из плазмы крупного рогатого скота соответственно (200 Ед/мл) и стерильный фильтр (фильтр пор 0,2 мкм). Аликвотировать 200 мкл в криптопробирки и хранить при -20 °C.
- Для 30 культур готовят 100 мл питательной среды (см. перечень материалов).
3. Рассечение ткани спинного мозга
Примечание: Процедура, в зависимости от количества эмбрионов, дает срезы спинного мозга примерно для 25 - 35 сокультур и готовится внутри ламинарного колпака в стерильных условиях.
- Применяют смертельную дозу пентобарбитала (0,4 мл) животному-матери путем внутримышечной инъекции. Подтвердите глубокую анестезию, проверив рефлекс отмены педали. Доставить эмбрионы крыс на 14-й день (E14) путем кесарева сечения и принести в жертву путем обезглавливания.
- Переложите тела эмбрионов в чашку Петри, наполненную стерильным, охлажденным, моющим раствором.
- Выполните один полный поперечный разрез скальпелем над задними конечностями и другой над передними конечностями и удалите конечности от тела. Далее сделайте разрез во фронтальной плоскости, чтобы отделить внутренности от задней части, содержащей спинной мозг.
- Для нарезки задние части, содержащие спинной мозг, переносят по одной на монтажный диск и разрезают толщиной 225 - 250 мкм с помощью тканевого измельчителя. Капните каплю моющего раствора на измельченную ткань и переложите ломтики шпателем в чашки Петри размером 35 мм х 10 мм, наполненные стерильным, охлажденным, моющим раствором.
- Для каждого среза отдельно рассекайте спинной мозг в сторону от оставшихся тканей. Оставьте ганглии заднего корешка прикрепленными.
- Дайте ломтикам постоять 1 час при температуре 4 °C.
4. Монтаж срезов ткани спинного мозга на MEA
- Прогрейте стерильную питательную среду в инкубаторе (37 °С, слегка приоткрыв крышку для насыщения кислородом).
- Расположите МЭА стерильным пинцетом с резиновыми наконечниками в точке Петри в чашке Петри под стереомикроскопом так, чтобы электродная решетка была в фокусе. Центрируйте каплю куриной плазмы объемом 6 мкл на чистой, беспыльной и стерильной электродной решетке. С помощью небольшого шпателя осторожно проведите два участка спинного мозга вентральными сторонами друг к другу в каплю плазмы. Не прикасайтесь шпателем к электродам.
- Добавьте 8 мкл тромбина вокруг куриной плазменной капли. С помощью наконечника для тромбиновой пипетки тщательно перемешайте и распределите смесь куриной плазмы и тромбина вокруг двух ломтиков. Опять же, не прикасайтесь к хрупкой электродной решетке напрямую. Непосредственно перед коагуляцией аспирируйте избыток куриной плазмы/тромбина.
- Закройте чашку Петри крышкой, чтобы сохранить высокую влажность, в то время как сборка MEA/культура находится около 1 часа в увлажненной камере внутри инкубатора при температуре 37 °C.
- Осторожно добавьте 10 μл питательной среды в камеру для культивирования, закройте чашку Петри крышкой и снова уберите в инкубатор примерно на 30 минут.
- Поместите каждую сборку MEA/culture со стерильными, покрытыми резиной наконечниками в роликовую трубку, добавьте 3 мл питательной среды и плотно закройте крышку. Поместите роликовую трубку в роликовый барабан, вращающийся со скоростью 1 - 2 об/мин в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5%CO2 при температуре 37 °C.
- Меняйте половину питательной среды через 7 дней in vitro (DIV) и после 1 - 2 раза в неделю.
5. Механические повреждения
- Извлеките сборку MEA/culture со стерильными, покрытыми резиной наконечниками из роликовой трубки и поместите в чашку Петри без питательной среды под стереомикроскопом с фокусом на ткани. Визуально убедитесь, что два среза сплавлены.
- Удерживайте узел MEA/культура неподвижно, поместив пинцет с наконечниками с резиновым покрытием на MEA.
- Поместите лезвие скальпеля в канавку MEA рядом с срезами ткани. Держите скальпель достаточно горизонтально.
- Поднимите рукоятку скальпеля вверх, но оставьте лезвие скальпеля в канавке MEA таким образом, чтобы лезвие «скатывалось» от основания к кончику и тем самым разрезало ткань, покрывающую канавку.
- При необходимости устраните любые остаточные тканевые соединения кончиком иглы 25 G. Работайте только в области внутри канавки и не касайтесь нежных краев.
- Поместите узел MEA/культура обратно в роликовую трубу. Обеспечьте культуры 3 мл свежей питательной среды и поместите их обратно в барабан в инкубаторе.
6. Электрофизиологические записи спонтанной активности
- Чтобы исследовать функциональную регенерацию между двумя срезами спинного мозга после выбранного числа DIV, установите сборку MEA/культуру в записывающую камеру на микроскопе и нанесите около 500 мкл внеклеточного раствора (см. список материалов).
- Подождите 10 минут перед первой записью, чтобы система стабилизировалась.
- Запишите основную спонтанную активность 2 раза в течение примерно 10 минут с каждого электрода, детектирующего активность MEA в режиме RT.
- Чтобы обеспечить стабильные внеклеточные условия, обменивайте внеклеточный раствор после каждого сеанса записи.
