1. Затравка человеческих ИПСК в биореакторе
- Инкубируют иПСК, выращенные в виде монослоев в mTeSR1 с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 (ROCKi). Добавьте 1 мл добавки среды в каждую лунку из 6-луночного планшета для культуры тканей и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C, влажности 95% и 5% CO2,
заметка: ROCKi используется для защиты диссоциированных иПСК от апоптоза.
- Через 1 ч инкубации отасуньте отработанную среду из каждой лунки и промойте 1 мл 1× PBS на лунку.
- Добавьте 1 мл среды для отделения клеток (см. Таблицу материалов) в каждую лунку 6-луночного планшета и инкубируйте при 37 °C в течение 7 мин до тех пор, пока клетки не будут легко отделяться от лунок с помощью легкого встряхивания.
- Пипетируйте среду для отделения клеток вверх и вниз с помощью микропипетки P1000 до тех пор, пока клетки не отделятся и не диссоциируют на отдельные клетки. Добавьте 2 мл полной среды для культивирования клеток в каждую лунку, чтобы инактивировать ферментативное расщепление, и аккуратно пипетируйте клетки в стерильную коническую пробирку.
- Центрифугируйте при 210 × г в течение 3 мин и удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют клеточную гранулу в культуральной среде (т.е. mTeSR1 с добавлением 10 мкМ ROCKi) и подсчитывают иПСК с помощью гемоцитометра с использованием трипанового синего красителя.
- Засемените 15 ×10 6 одиночных клеток в биореакторе (максимальный объем 100 мл) 60 мл mTeSR1 с добавлением 10 мкМ ROCKi при конечной плотности клеток 250 000 клеток/мл.
- Вставьте сосуд с иПСК в универсальный базовый блок, помещенный в инкубатор при температуре 37 °C, влажности 95% и 5% CO2,<бр/>
заметка: Перемешивание биореактора поддерживается в течение 24 часов путем установки универсального базового блока управления на 27 об/мин для содействия агрегации иПСК.
2. Дифференцировка и созревание агрегатов, полученных из iPSC человека, в мозжечковых органоидах
- Определите день посева одиночных ячеек как день 0.
- В 1-й день соберите 1 мл образца агрегатов iPSC с помощью серологической пипетки. Поддерживайте биореактор в состоянии перемешивания, как и раньше, поместив универсальный базовый блок вместе с биореактором, содержащим агрегаты, в стерильный поток перед сбором пробы. Поместите клеточную суспензию в 24-луночный планшет со сверхнизким уровнем прикрепления. Убедитесь, что сформированы агрегаты, полученные из iPSC.
- Получение изображений с помощью оптического микроскопа с использованием общего увеличения 40x или 100x для измерения совокупного диаметра.
- Измерьте площадь агрегатов на каждом изображении с помощью программного обеспечения FIJI.
- Выберите «Анализ | Установите измерения» в строке меню и нажмите на «Площадь» и «ОК».
- Выберите "Файл | Открыть» в строке меню, чтобы открыть сохраненный файл изображения. Выберите инструмент выделения линии, представленный на панели инструментов, и создайте прямую линию поверх масштабной линейки, представленной на изображении. Выберите «Анализ | Установить масштаб» в строке меню.
- В поле «Известное расстояние» добавьте масштабную линейку изображения в μм. Определите «Единицу длины» как μм. Нажмите на «Глобальный», чтобы сохранить настройки, и нажмите «OK». Выберите «Овальное выделение» на панели инструментов.
- Для каждого агрегата очертите область с помощью овального инструмента. Выберите «Анализ | Мера». Рассчитайте их диаметр исходя из измеренной площади, учитывая, что агрегаты имеют приблизительную сферическую форму с использованием
где A — площадь агрегата.
- При среднем диаметре заполнителей 100 мкм заменить 80% отработанной среды на свежий mTeSR1 без ROCKi. Когда агрегаты достигнут диаметра 200–250 мкм, замените всю отработанную среду на gfCDM (табл. 1), дав органоидам осесть на дне биореактора><.
заметка: Если средний диаметр заполнителя превышает 350 мкм, протокол дифференцировки не запускать. Повторите посев одиночных ячеек. Как правило, требуется около 1 дня, чтобы заполнитель достиг среднего диаметра 100 мкм.
- Вставьте биореактор с агрегатами в универсальное основание, помещенное в инкубатор при температуре 37 °C, влажности 95% и 5%CO2.
- Уменьшите перемешивание биореактора до 25 об/мин.
- В день 2 повторите шаги 2.2, 2.3 и 2.4 для оценки совокупного диаметра. Добавьте 30 мкл FGF2 (конечная концентрация, 50 нг/мл) и 60 мкл SB431542 (конечная концентрация, 10 мкМ) к 60 мл дифференцировочной среды gfCDM (табл. 1). Замените всю отработанную среду из биореактора на добавленную gfCDM. Повторите шаг 2.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: SB431542 имеет решающее значение для ингибирования мезендодермальной дифференцировки, индуцируя нейронную дифференцировку. FGF2 используется для стимуляции каудализации нейроэпителиальной ткани.
- На 5-й день повторите шаги 2.2, 2.3, 2.4 и 2.8.
заметка: Размер агрегата должен увеличиваться во время протокола дифференцировки. Тем не менее, диаметр имеет решающее значение только в начале дифференцировки, потому что этот параметр может повлиять на эффективность дифференцировки.
- На 7-й день повторите шаги 2.2, 2.3 и 2.4. Разбавьте FGF2 и SB431542 до 2/3: Добавьте 20 мкл FGF2 и 40 мкл SB431542 к 60 мл среды для дифференцировки gfCDM. Замените всю отработанную среду из биореактора на добавку gfCDM. Повторите шаг 2.6 и увеличьте перемешивание биореактора до 30 об/мин.
- На 14 день повторите шаги 2.2, 2.3 и 2.4. Добавьте 60 мкл FGF19 (конечная концентрация, 100 нг/мл) к 60 мл среды для дифференцировки gfCDM. Замените всю отработанную среду из биореактора на gfCDM с добавлением FGF19. Повторите шаг 2.6.
заметка: FGF19 используется для стимуляции поляризации средне-задних структур мозга.
- На 18-й день повторите шаги 2.2, 2.3, 2.4 и 2.11.
- На 21 день повторите шаги 2.2, 2.3 и 2.4. Замените всю отработанную среду из биореактора на полную нейробазальную среду (табл. 1). Повторите шаг 2.6.
заметка: Нейробазальная среда — это базальная среда, используемая для поддержания популяции нейронных клеток внутри органоида.
- На 28-й день повторите шаги 2.2, 2.3 и 2.4. Добавьте 180 мкл SDF1 (конечная концентрация, 300 нг/мл) к 60 мл полной нейробазальной среды. Замените всю отработанную среду из биореактора на полноценную нейробазальную среду с добавлением SDF1. Повторите шаг 2.6.
заметка: SDF1 используется для облегчения организации отдельных клеточных слоев.
- На 35-й день повторите шаги 2.2, 2.3 и 2.4. Замените всю отработанную среду из биореактора на полную среду BrainPhys (Таблица 1). Повторите шаг 2.6.
заметка: BrainPhys — это нейронная среда, которая поддерживает синаптически активные нейроны.
- Заменяйте 1/3 от общего объема каждые 3 дня полной средой BrainPhys до 90-го дня дифференцировки.
Таблица 1: Стоковые решения и подготовка среды. Перечислены все компоненты и объемы, используемые для подготовки сред для протокола поддержания и дифференцировки ИПССК, а также исходные растворы факторов роста и малых молекул. Для исходных растворов перечислены все концентрации в запасе и протоколы по восстановлению.
RT
| Подготовка носителя | mTeSR1
Конечный объем: 500 мл | 1. Разморозьте mTeSR1 5× добавьте при комнатной температуре (RT) или при 4 °C в течение ночи и смешайте с базальной средой
2. Храните полную среду mTeSR1 при температуре 4 °C до 2 недель или приготовьте 40 мл аликвот и храните при температуре -20 °C
3. Перед использованием полностью разогрейте mTeSR1 при температуре |
gfCDM (химически определенная среда без факторов роста)
Конечный объем: 60 мл | 30 мл Ham's F12 30 мл IMDM 600 мкл химически определенный липидный концентрат (1 % v/v) 2,4 мкл монотиоглицерина (450 μM) 30 мкл апо-трансферрина (стоковый раствор при 30 мг/мл в воде, конечная концентрация: 15 мкг/мл) 300 мг кристаллизованный BSA (5 мг/мл) 42 μл инсулина (стоковая концентрация при 10 мг/мл, конечная концентрация: 7 мкг/мл) 300 мкл/с (0,5% v/v, 50 ед/мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина) |
Нейробазальный
Конечный объем: 60 мл | 60 мл нейробазальной среды 600 мкл N2 добавка 600 мкл Глутамакс I 300 мкл/с (0,5 % v/v). |
Полный BrainPhys
Конечный объем: 60 мл | 60 мл BrainPhys 1,2 мл NeuroCult SM1 Neuronal Supplement 600 μL N2 Supplement 12 μL BDNF (конечная концентрация: 20 нг/мл) 12 μL GDNF (конечная концентрация: 20 нг/мл) 300 μL Dibutyryl-cAMP (исходная концентрация: 100 мг/мл в воде, конечная концентрация: 1 мМ) 42 μL аскорбиновая кислота (исходная концентрация: 50 мкг/мл в воде, конечная концентрация: 200 нМ) |
| Стоковые растворы факторов роста и малых молекул | Основной фактор роста фибробластов (bFGF/FGF2)
Исходная концентрация: 100 мкг/мл | 1. Восстановите в 5 мМ Трис, pH 7,6, в концентрации 10 мг/мл
2. Разбавьте 0,1 % BSA в PBS (v/v) до конечной концентрации 100 мкг/мл |
Фактор стромальных клеток 1 (SDF1)
Исходная концентрация: 100 мкг/мл | 1. Восстановите в воде в концентрации 10 мг/мл
2. Разбавьте 0,1 % BSA (v/v) в PBS до конечной концентрации 100 мкг/мл. |
Нейротрофический фактор мозга (BDNF)
Исходная концентрация: 100 мкг/мл< |
Нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF)
Исходная концентрация: 100 мкг/мл |
Фактор роста фибробластов 19 (FGF19)
Исходная концентрация: 100 мкг/мл | 1. Восстановите в 5 мМ фосфат натрия, pH 7,4, в концентрации 10 мг/мл
2. Разбавьте 0,1 % BSA в PBS (v/v) до конечной концентрации 100 мкг/мл |
Ингибитор ROCK Y-27632
Концентрация материала: 10 мМ | Восстановите в ДМСО при концентрации 10 мМ. |
| SB431542< спальня />
Концентрация материала: 10 мМ |
Инсулин
Исходная концентрация: 10 мг/мл | 1. Восстановите 10 мг инсулина в 300 мкл 10 мМ NaOH
2. Осторожно добавьте 1 М NaOH до тех пор, пока раствор не станет прозрачно-прозрачным
3. Наполните до 1 мл стерильной водой |
Таблица 2: Растворы для получения органоидов для криосекции и иммуноокрашивания. Перечислены все компоненты и объемы, использованные для приготовления растворов, используемых при получении органоидов для криосекции и иммуноокрашивания.
%
Желатин/Сахароза
Конечная концентрация: 7,5%/15% по мас. | 1. Взвесьте 15 г сахарозы и 7,5 г желатина в стерильной стеклянной бутылке Schott Glass Bottle и хорошо перемешайте<бр/>
2. Предварительно прогрейте PBS 1× при 65 °C
3. Добавьте предварительно подогретый PBS 1× к итоговой массе 100 г и хорошо перемешайте
4. Поместите стеклянную бутылку Schott в нагревательную тарелку при температуре 65 °C и встряхивайте, пока желатин не растает
5. Инкубировать при 37 °C до стабилизации раствора |
