Выделение инфильтрирующих опухоль иммунных клеток из головного мозга мышей

Аннотация

Источник: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Выделение и проточный цитометрический анализ мононуклеарных клеток периферической крови, инфильтрирующих глиому. J. Vis. Exp. (2015)

Видео демонстрирует выделение мононуклеарных клеток периферической крови, инфильтрирующих опухоль, из мозга мыши с помощью механической диссоциации и ферментативного пищеварения. Затем следует центрифугирование с градиентом плотности для сбора иммунных клеток для дальнейшего анализа.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

Приготовьте раствор для центрифугирования плотной среды, поместив 90 мл 10x PBS в 264 мл сверхчистой деионизированной воды (3,93x) в стерильный пластиковый контейнер. Титровать до pH 7,0-7,2 с помощью HCl и стерилизовать фильтром через фильтр 0,22 мкм. Хранить при температуре 4 °C.

Приготовьте центрифугирующую среду плотностью 70%, соединив 18 мл раствора для центрифугирования плотности с 30 мл центрифугирующей среды плотности (подробнее см. список материалов) в полипропиленовой центрифужной пробирке объемом 50 мл. Хранить при температуре 4 °C, но перед использованием довести до RT

.

Приготовьте центрифугирующую среду плотностью 37%, соединив 9,6 мл DPBS с центрифугирующей средой 70% плотностью 10,4 мл в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Хранить при температуре 4 °C, но перед использованием довести до RT

.

1. Изоляция глиом-инфильтрирующих PBMC

1. Используя чистое лезвие бритвы с одним лезвием, изолируйте область мозга, содержащую опухоль, сделав сагиттальный разрез в центре мозга, чтобы разделить два полушария пополам. Поверните ипсилатеральное полушарие медиальной стороной вниз и сделайте два корональных разреза на уровнях мозжечка и обонятельной луковицы, чтобы изолировать ткань-мишень, содержащую опухолевый имплантат (рис. 1А). Эквивалентная часть контралатерального полушария также может быть изолирована и использована в качестве отрицательного контроля.
2. Поместите целевую ткань в соответствующую маркированную стеклянную кофемолку Dounce, содержащую 1 мл DPBS, нажмите на поршень до упора и поверните 7 раз, чтобы первоначально разрушить ткань. Поднимите поршень, чтобы жидкость осела обратно на дно измельчителя салфеток. Повторите этот шаг трижды; Однако поворачивайте поршень только 4 раза во время следующих двух повторов и 3 раза во время последнего повтора, чтобы избежать чрезмерного растирания ткани.
3. С помощью микропипетки P-1000 последовательно нанесите три объема 1 мл ледяного DPBS по бокам поршня для полоскания в измельчитель тканей.
4. Восстановите суспендию растиранного мозгового вещества путем пипетирования вверх и вниз и поместив его в пробирку с маркировкой объемом 15 мл на льду. Промойте боковые стороны измельчителя тканей Dounce 1 мл ледяного DPBS и добавьте в ту же центрифужную пробирку объемом 15 мл. Держите все пробирки с растиранным мозговым веществом на льду до тех пор, пока все образцы не будут обработаны.
5. После обработки всех образцов растертое мозговое вещество в центрифужных пробирках объемом 15 мл при давлении 740 x g (макс. RCF) в течение 20 минут при 4 °C.
6. Удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и дозатора и ресуспендируйте гранулированное вещество мозга в 1 мл предварительно приготовленных пищеварительных ферментов коллагеназы/ДНКазы-I с помощью P-1000. Поместите центрифужные пробирки объемом 15 мл в штатив для пробирок и поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 15 минут.
7. Осторожно перемешивайте образцы дважды в течение инкубационного периода, переворачивая пробирки, чтобы облегчить дезагрегацию тканей.
8. Добавьте 6 мл ледяного DPBS с помощью серологической пипетки объемом 10 мл в каждую пробирку, чтобы разбавить пищеварительные ферменты. Проводите пипетку вверх и вниз для повторного подпитки и фильтруйте общий объем через стерильные нейлоновые сетчатые фильтры 70 мкм в новые пробирки для центрифуг объемом 15 мл с маркировкой на льду.
9. Вращайте суспензию клеток мозга при 740 x g (max RCF) в течение 20 минут при 4 °C, чтобы получить гранулу из одной клетки (рис. 1B). После извлечения пробирок объемом 15 мл из центрифуги поместите их на лед и увеличьте температуру на центрифуге примерно до 21 °C для подготовки к следующему этапу.
10. Полностью удалите надосадочную жидкость из каждой пробирки, содержащей клетки мозга, и первоначально повторно суспендируйте гранулы в 1 мл центрифугирующей среды 70% плотности с помощью микропипетки P-1000. Затем добавьте в каждую пробирку еще 4 миллилитра центрифугирующей среды 70% плотности с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Надежно закрутите крышки и гомогенизируйте клеточную суспензию, аккуратно перевернув ее в пробирки несколько раз.
11. Извлеките изо льда центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие клетки мозга, ресуспендированные в центрифужной среде с плотностью 70%, и поместите их в штатив для пробирок в режиме RT. По очереди аккуратно нанесите 2 мл раствора центрифугирующего фильтрующего материала плотностью 37% на 5 мл центрифугирующего фильтрующего материала плотностью 70% с помощью микропипетки P-1000, чтобы образовалась чистая граница раздела между двумя слоями центрифугирующего материала (рис. 1C).
    1. Используйте маркер с тонким наконечником для обозначения положения интерфейса, чтобы его можно было легко идентифицировать после центрифугирования, когда различие становится менее заметным.
12. Поворачивайте центрифужные пробирки объемом 15 мл при давлении 740 x g (макс. RCF) в течение 20 минут при RT без перерыва, чтобы не нарушить работу интерфейса.
13. После центрифугирования соберите PBMC, скопившиеся на границе между двумя слоями центрифугирующей среды плотности (рисунок 1D), введя микропипетку P-200 в пробирку вдоль ее стороны, осторожно обходя липидный слой.
    1. Оказавшись на уровне полосы PBMC, медленно извлеките 200 мкл с поверхности слоя центрифугирующего материала плотностью 70% и поместите его в соответствующую маркированную полипропиленовую пробирку FACS на льду. Повторите один раз для общего объема 400 мкл на образец.
14. Добавьте 3 мл проточного буфера в каждую пробирку FACS, содержащую 400 μл PBMC, чтобы в достаточной степени разбавить плотность центрифугирующей среды, затем открутите ячейки при 660 x g (max RCF) в течение 20 минут при 4 °C.

Результаты

Рисунок 1: Изоляция глиом-инфильтрирующих PBMC. (А) Стратегия вскрытия ткани мозга мыши, содержащей имплантаты ортотопической глиомы на ранней стадии. Верхняя панель демонстрирует сагиттальную бисекцию ипсилатерального полушария в сторону от контралатерального полушария. На нижней панели показаны два дополнительных коронарных разреза, необходимых для выделения целевой ткани, содержащ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модификация Дульбекко Eagles Medium	Gibco	12430-054	Содержит 4,5 г/л D-глюкозы, L-глютамина, 25 мМ HEPES и фенола красного
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко	Gibco	14190-144	Без хлорида кальция или хлорида магния
Фетальная бычья сыворотка	Омега Сайентиал Инк.	ФБ-11
Пенициллин стрептомицин	Gibco	15140-122	10 000 ЕД/мл пенициллин; 10 000 г/мл стрептомицин
0,6 мл конические полипропиленемические микротрубки	Дженеси Сайентиал	22-272
Полиуретановое ведро для льда	Фишербранд	Тел.: 02-591-45	Емкость: 0,152 унции (4,5 л)
Коллагеназа (тип I-S)	Сигма Олдрич	Ок1639 г.	Из Clostridium histolyticum
Дезоксирибонуклеаза I	Уортингтонская биохимическая корпорация	LS002007	>2 000 единиц Куница на мг сухого веса
Большие ножницы для препарирования	Тед Пелла Инк.	1316
Маленькие ножницы для рассечения	ФСТ	14094-11
Тупые концевые щипцы	Тед Пелла Инк.	No 13250
Стеклянная шлифовальная машина Dounce 7 мл	Контес	KT885300-0007
Центрифугирующая среда Percoll Density	GE Healthcare	ГЭ17-0891-01
Серологические пипетки объемом 10 мл	Дженеси Сайентиал	12-104	Одноразовый; стерильный
70 мкм стерильные нейлоновые сетчатые сетчатые фильтры	Фишербранд	22363548
Полипропиленовые центрифужные пробирки 15 мл	Дженеси Сайентиал	21-103	Коническое дно
Полипропиленовые центрифужные пробирки 50 мл	Дженеси Сайентиал	21 — 108	Коническое дно
12x75 мм полипропиленовые трубки FACS с круглым дном	Фишербранд	14-956-1Б

гг. г.