$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление инструментов, питательных сред и блюд
- Подготовьте два лабораторных ножницы для препарирования из нержавеющей стали и два лабораторных щипца из нержавеющей стали. Автоклавируйте все инструменты и поместите в культуральный колпак О/Н под ультрафиолетовым (УФ) светом для стерилизации.
- Внесите 500 мл питательной среды минимально необходимой среды (MEM) (10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 20 мМ KCl, 25 мМ NaHCO3, 30 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 6 мкг/мл ампициллина) и простерилизуйте фильтром. Хранить при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев.
- Подготовить 24 луночные культуральные пластины, содержащие покровные стекла толщиной 14 мм, No 1. Автоклав покровных стекол и покрытие в 100 мг/л поли-d-лизина (PDL). Стерилизация ультрафиолетовым светом О/Н.
2. Приготовление культуральных растворов гранулярных клеток мозжечка (CGC)
- Приготовьте 'раствор А' (100 мл) в автоклавированном, обработанном ультрафиолетовым излучением, стерильном dH2O, содержащем 250 мг глюкозы, 300 мг бычьего сывороточного альбумина [BSA], 955 мг фосфатно-солевого буфера [PBS] (Ca2+ и Mg+ free) и 1 мл 3,8% MgSO4·7H2O.
- Приготовьте раствор В (10 мл), содержащий 1 мл 5 мг/мл трипсина, разведенного в 9 мл раствора А.
- Приготовьте раствор С' (10 мл), содержащий 1000 единиц ДНКазы, 0,5 мг ингибитора трипсина сои, 100 мкл 3,8% MgSO4·7Н2О, разведенный до 10 мл раствором А.
- Приготовьте 'раствор D' (20 мл), содержащий 3,2 мл раствора С, разведенный до 20 мл раствором А.
- Приготовьте раствор BSA/сбалансированного солевого раствора Эрла (EBSS), содержащий EBSS, 25 мМ NaHCO3, 3 мМ MgSO4·7H2O и 4% BSA, pH 7,4.
- Приготовьте метиловый эфир L-лейцина (LME) путем добавления чистого LME в 5 мл питательной среды MEM для получения конечной концентрации 150 мМ LME, верните раствор до pH 7,4 с помощью настольного pH-метра и простерилизуйте фильтр с помощью 28 мм шприцевого фильтра из полиэфирсульфона (PES) 0,2 мкм.
3. Культивирование CGC
- Соберите мозжечок с 4-7-дневных крысят. Немедленно поместите в чашку Петри, содержащую 5 мл раствора А на лед.
- Слейте излишки раствора с мозжечка и поместите салфетку в крышку чашки Петри.
- Мелко нарежьте ткань хорошо прокаленным лезвием бритвы как минимум в трех разных направлениях.
- Добавьте измельченную ткань в раствор B (промойте чашку Петри раствором, чтобы предотвратить потерю ограниченного количества ткани) и поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 5 минут. Осторожно встряхивайте каждые пару минут.
- Добавьте раствор D (20 мл) в пробирку для нейтрализации трипсина, встряхните и центрифугируйте при 65 х г в течение 5 минут.
- Слить надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте в 4 мл раствора С. Хорошо растирайте (примерно по 10 раз каждая) тремя стеклянными пипетками с пламенем уменьшающегося диаметра, пока суспензия не станет максимально однородной.
- Медленно и осторожно добавьте несколько капель этого гомогената поверх BSA/EBSS. Если он начинает опускаться через BSA/EBSS, растирайте больше и/или добавьте еще немного раствора C. Гомогенат должен находиться слоем поверх BSA/EBSS. Не трясите. Вращайте при 100 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу (мягкую) в 1 мл среды MEM.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и планшета при концентрации 800 000 клеток/покровное стекло в 500 мкл среды MEM. Поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 6% CO2.
- Смените среду на следующий день (через 24-36 часов после подготовки). Приготовьте раствор среды MEM, содержащий 10 мкМ ингибитора клеточного цикла арабинофуранозилцитидина (AraC).
- Для каждого покровного стекла сохраните 250 μл старой среды в свежем 24-луночном планшете, отсадите оставшуюся часть, добавьте 250 μл нормальной среды MEM и аспирируйте это, чтобы промыть клетки. Затем добавьте 250 μл старой среды обратно в ячейки и добавьте 250 μл среды, содержащей AraC.
заметка: Клетки можно использовать с 6 дней in vitro (DIV).
4. Выборочное истощение микроглии (выполняется при 6 DIV)
- Добавьте чистую LME к 5 мл отдельной аликвоты среды MEM до получения конечной концентрации 150 mM LME.
- Верните раствор к pH 7,4 и простерилизуйте фильтр с помощью шприцевого фильтра 28 мм из полиэфирсульфона (PES) 0,2 мкм.
- Раствор развести до концентрации 50 мМ (2 x LME) в среде MEM и поместить на водяную баню при 37 oC на 10 мин вместе с обычной средой MEM для контрольных культур.
- Удалите половину (250 мкл) МЭМ-среды из культур CGC и сохраните при температуре 37 °C.
- Обрабатывайте клетки средой MEM, содержащей 2 x LME (250 μl), т.е. разбавленной 1:1 с получением концентрации в лунке 25 мМ, или предварительно подогретой средой MEM без LME (250 μl) для контрольных культур.
- Инкубируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере с 6%CO2 в течение 1 часа.
- Дважды промыть ячейки в свежей предварительно подогретой МЭМ-среде для удаления ЛМЭ-содержащей среды, а затем заменить оставшуюся питательную среду и равный объем свежей предварительно подогретой МЭМ-среды в соответствующие лунки.
- Верните культуры в инкубатор (увлажненные 6%CO2 при 37 °C) и оставьте на 24 часа перед дальнейшей обработкой.