Протокол извлечения мозговой ткани из 1-го дня крыс Sprague Dawley, усыпленных путем обезглавливания, был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Альберты.
1. Выделения микроглии и астроцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды для выделения и культивирования клеток предварительно нагреваются до 37 °C на водяной бане. Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) содержит 1% пенициллин-стрептомицина (PS). Все модифицированные среды Dulbecco Eagle's со смесью питательных веществ Ham's F12 (DMEM/F12) дополнены 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (PS). Только смеси с трипсином лишены FBS. Все материалы в этом протоколе стерильны (фильтрующие, спиртовые, покупные и автоклавные), и каждый шаг после шага 1.8 выполняется в шкафу биобезопасности с использованием асептической техники.
- Для каждого мозга предварительно нагрейте 15 мл HBSS и 12,5 мл DMEM/F12 до 37 °C в конических центрифужных пробирках объемом 50 мл и приблизительно 2 мл 0,25% трипсина с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) в конической центрифужной пробирке объемом 15 мл. Нагрейте еще 25 мл DMEM/F12. Подогрейте трипсин примерно за 10 минут до использования, чтобы предотвратить потерю ферментативной активности.
- Насыпьте достаточно теплого HBSS в стерильную посуду для культуры на 6 и 10 см, чтобы покрыть поверхность. Приготовьте одну посуду 10 см на каждые два мозга плюс дополнительную посуду 6 см.
- Поместите до 2 мозгов в каждую посуду диаметром10 см 2 (рисунок 1А).
- Под диссекционным микроскопом с помощью изогнутых и прямых щипцов отделяют кору головного мозга по средней линии, а мозжечок – со стволом мозга. В результате получается три участка ткани на мозг (рис. 1B).
- Очистите тонкий, полупрозрачный, слой (мозговые оболочки) ткани, содержащей кровеносные сосуды, с каждого участка ткани и выбросьте, переложив оставшуюся ткань в отдельную чашку для культуры. Возьмитесь щипцами за тонкие слои, обнаженные от разрезов ткани, и осторожно потяните, пока основные участки не «свисают» с ткани мозга. Наконец, удалите эту часть, осторожно потянув. На рисунке 1C-1E приведены репрезентативные изображения до, во время и после этого этапа.
- В шкафу биобезопасности удалите остатки HBSS из чашки для культивирования, бережно сохраняя ткань. Измельчите ткань скальпелем и перенесите ткань в предварительно нагретую 15 мл пробирку с трипсином.
- Инкубируйте эту трубку в течение 25 минут в ванне при температуре 37 °C, чтобы переварить ткань ферментативным путем.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 500 х г в течение 2 минут при комнатной температуре и вылейте надосадочную жидкость.
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте 10 мл теплого DMEM/F12, чтобы инактивировать трипсин, и растирайте раствор 5 раз, чтобы разрушить ткань.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 500 х г в течение 2 минут при комнатной температуре и вылейте надосадочную жидкость.
- С помощью серологической пипетки объемом 10 мл повторно суспендируйте гранулу в 10 мл теплого DMEM/F12 и переложите раствор в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- С помощью шприца объемом 10 мл с иглой 18 калибра разотрите раствор 3 раза.
- Распределите этот раствор с шагом 12,5 мл теплого DMEM/F12 на мозг.
- Пипеткой с шагом 1 мл растиранного раствора в 12-луночный планшет (по 1 на мозг).
- Инкубировать при 37 °C и 5%CO2 в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур. Носители заменяются через три дня, а обновляйте их каждые последующие три дня. Через 2 недели клетки можно собирать для экспериментов.
2. Синтез макромеров
- Взвесьте 375 мг соли гиалуроновой кислоты (ГК) в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл и добавьте 37,5 мл дистиллированной воды.
- Промойте раствор вихревым аппаратом в течение 1 минуты и обрабатывайте смесь ультразвуком до тех пор, пока она не станет однородной и не потеряет свою гелеобразную вязкость. Этот процесс может занять 6 часов.
- Перелейте раствор в стакан объемом 100 мл с магнитной мешалкой (38 мм) и энергично перемешайте при комнатной температуре.
- Осторожно титруйте 5,0 М NaOH в смесительную ГК и измеряйте с помощью pH-бумаги до тех пор, пока pH не стабилизируется в диапазоне от 8 до 12.
- Соберите 3 мл свежего метакрилового ангидрида (MA, 94%), покрытого азотом во время хранения.
заметка: МА подвергается воздействию атмосферы в течение длительного времени (дней), она теряет свою реакционную способность.
осторожность: Все случаи использования MA должны производиться в вытяжном шкафу.
- Добавьте 200 μL MA в раствор для смешивания ГК. Реакция понижает pH раствора ниже 8.
- Повторяйте шаги с 2.4 по 2.6 до тех пор, пока в раствор не будет добавлено 3 мл МА. Этот процесс может занять до 1-2 часов.
- Дайте реакции продолжаться в течение ночи при температуре 4 °C, не перемешивая.
- Перелейте раствор в 400 мл холодного этанола (EtOH) в стакан объемом 500 мл и дайте осадку в течение 24 - 72 часов при 4 °C.
- Осторожно сцедите большую часть раствора в отдельную мензурку для утилизации, а осадок соберите в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл. При необходимости его можно распределить по 2-4 пробиркам.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 200 х г в центрифуге в течение 2 мин при комнатной температуре и утилизируйте надосадочную жидкость.
- Долить в пробирку холодный EtOH, перемешать раствор с вортексером в течение 1 минуты, и повторить шаг 2.10-2.11.
- Добавьте 25 мл стерильной деионизированной воды, перемешайте раствор с вихревым аппаратом в течение 1 мин, обрабатывайте ультразвуком (>20 кГц) в течение 1 ч и выдерживайте при 4 °C в течение ночи.
- Поместите раствор в морозильную камеру при температуре -80 °C на 15 минут или до тех пор, пока он не замерзнет или не замерзнет в жидком азоте.
осторожность: При использовании жидкого азота используйте защитные перчатки, лицевой щиток и фартук.
- Сублимационную сушку пробирки (ниже 0,1 мБар и -30 °C) в течение 24–48 часов до образования снежного порошка.
- На этом этапе проверьте образец на чистоту с помощью ядерного магнитного резонанса 1Н, где может быть подтверждено количество метакрилатных протонов (пики 6,1 и 5,6 ppm) по отношению к метилпротонам (1,9 ppm) на основе HA. Минимальное соотношение метакрилата к метилпротонам составляет 95%.
3. Образование геля и 3D-инкапсуляция
- Подготовка покровного стекла и пресс-формы
- Приготовьте 50 мл дистиллированного водного раствора 2% 3-(триметоксисилил) пропилметакрилата в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл.
- Поместите стеклянные покровные стекла 18 мм в раствор и поверните на 1 ч при комнатной температуре. За один раз можно добавить до 50 защитных колпачков.
- Промойте покровные стекла, последовательно опустив каждый в 3 стакана с 100 мл деионизированной воды.
- Высушите покровные стекла в вакууме при температуре 40 °C в течение ночи с помощью эксикатора и духовки.
- Быстро погружайте отдельные покровные стекла в 70% EtOH с помощью щипцов.
- Не высыхая, опустите каждую покровную крышку в лунку 12-луночной пластины.
- Промойте и аспирируйте каждую лунку стерильной деионизированной водой (1 мл на лунку).
- Добавьте по 1 мл стерильного поли-L-лизина (ФАПЧ) 2 мкг/мл в каждую лунку и инкубируйте в течение >2 ч.
- Отсадите раствор ФАПЧ и дайте покровным стеклам высохнуть на воздухе.
- Погрузите формы на основе полидиметилсилоксана (PDMS) (см. Рисунок 2) в 70% EtOH и поместите одну из них в центр каждого покровного стекла, дайте им высохнуть на воздухе и создать уплотнение между формой и стеклом.
- Подготовьте пресс-формы PDMS путем заливки премиксных реагентов PDMS в соотношении 10:1 в полистирольную чашку с плоским дном. Количество подготовленного PDMS подбирается таким образом, чтобы получить лист толщиной около 1 мм. Для формирования лунок в ПДМС разрежьте листы круглым дыроколом с внутренним диаметром 10.
- Подготовка клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в протоколе выполняются с использованием стерильной техники в шкафу биобезопасности. Раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) регулируется до pH 7,4 на всех этапах.
- За 24 ч до инкапсуляции клеток в метакрилатированную гиалуроновую кислоту (HAMA) обновите среду для 2-недельного первичного посева (начиная с шага 1.15) в 12-луночных планшетах. Добавьте 1 мл среды DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) на лунку.
- Для каждого 12-луночного планшета клеток готовят 12,5 мл разбавленного трипсина (0,25% трипсина-ЭДТА, разбавленного на 30% средой DMEM/F12) и 25 мл DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) и нагревают до 37 °C на водяной бане.
- Соберите кондиционированную среду из планшетов с помощью серологической пипетки объемом 10 мл (> 0,5 мл на лунку), тщательно отасуньте оставшуюся жидкость и замените ее 1 мл на лунку разбавленного трипсина (0,075% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]) в течение 20-30 минут в инкубаторе (37 °C, 5%CO2) до тех пор, пока сливающийся слой клеток не отделится от планшета.
- Соберите взвешенный материал клеток с помощью пипетки объемом 1 мл (выглядит как один плавающий кусок) и соберите его в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Разбавьте эквивалентным объемом DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS) и центрифугируйте при 200 x g в течение 2 минут при комнатной температуре, удаляя надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл теплого DMEM/F12 (10% FBS и 1% PS), разрастите клетки 5 раз с помощью пипетки объемом 10 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 2 минут.
- Сцедите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в теплой 5 мл DMEM/F12 и переложите клетки в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- С помощью шприца объемом 10 мл с иглой 18 калибра растираем клеточный раствор 3 раза и фильтруем суспензию через клеточное сито 40 мкм в новую коническую центрифужную трубку.
- Соберите 10 мкл клеточной суспензии, разведите 1:100 в теплом DMEM/F12 и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток.
- Инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C до стадии инкапсуляции.
- Инкапсуляция ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в протоколе выполняются с использованием стерильной техники в шкафу биобезопасности.
- На каждую 12-луночную пластину с 3D-гидрогелями нагрейте 12,5 мл DMEM/F12 и 12,5 мл кондиционированной среды DMEM/F12, собранной во время подготовки клеток.
- Измерьте необходимое количество HAMA для конечной концентрации 0,5% мас./об. Растворите эту HAMA в стерильном отфильтрованном PBS в концентрации (2% масс./об.); концентрация, в 4 раза превышающая конечную концентрацию, используется для добавления клеток и других реагентов. Для одной 12-луночной чашки гидрогелей требуется ~350 μL PBS с 7 мг HAMA.
- Растворы ультразвуковой обработки (>20 кГц) до полного растворения HAMA в течение 60 мин.
- Приготовьте индивидуальные 10% растворы триэтаноламина (ТЭА) и 1-винил-2-пирролидинона (НВП), а также 1 мМ раствор Эозина Y (EY) в 1 мл аликвот стерильного PBS pH 7,4.
- Для одного 12-луночного планшета приготовьте окончательную смесь объемом 1,4 мл из 1 x 107 клеток, 0,5% масс./об.м HAMA (350 μл 2% масс./об.), 0,1% TEA (14 μL 10%), 0,1% NVP (14 μL 10%) и 0,01 mM EY (14 μL 1 mM) и 20% смесь базальной пластинки (280 μL запаса). Оставшийся объем – это PBS.
- Аккуратно перемешайте раствор и нанесите пипеткой по 100 мкл в каждую форму PDMS с наконечником объемом 1 мл.
- Подвергайте образцы воздействию зеленого светодиодного света высокой интенсивности (~520 нм, 60 мВт, в закрытой коробке размером 20 см x 20 см x 20 см) в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 1 мл теплого кондиционированного DMEM/F12 в 12-луночный планшет.
- Возьмитесь за каждый покровный лист между большим и указательным пальцами, медленно снимите форму PDMS изогнутым пинцетом, стараясь не вытеснить гель, и поместите его в лунку с кондиционированной средой.
- Добавьте еще 1 мл теплого DMEM/F12 в каждую лунку.
- Инкубируйте планшеты при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 недель, обновляя клеточную среду каждую неделю, пипетируя 1 мл среды из каждой лунки и заменяя на 1 мл DMEM/F12.
