1. Клеточная культура и подготовка реагентов
- Подготовьте покрытые покрытием планшеты для культивирования клеток.
- Разбавьте раствор покрытия внеклеточного матрикса (ECM) средой DMEM/F12 для получения исходного раствора 1 мг/мл. Разбавленный исходный раствор ЭХМ разложить на 30 конических пробирок по 3 мл каждая и немедленно хранить при температуре -20 °С. Для получения рабочего раствора ресуспендируйте 3 мл заготовки ECM в 33 мл предварительно охлажденной среды DMEM/F12, доведя общий объем до 36 мл при концентрации 80 мкг/мл.
- Нанесите мазок 1 мл на лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток рабочим раствором ВКМ. Добавьте еще 1 мл DMEM/F12 в лунку (при необходимости), чтобы убедиться, что поверхность лунки полностью покрыта. Перед использованием 6-луночные планшеты для клеточных культур с покрытием постоять при комнатной температуре не менее 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с покрытием можно хранить в инкубаторе или при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовьте составы сред, факторы роста и малые молекулы.
- Чтобы приготовить 500 мл среды для плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), добавьте 20x и 500x добавок в соответствии с инструкциями производителя.
- Чтобы приготовить 500 мл нейронной среды (NM), добавьте гепарин до конечной концентрации 2 мг/мл, 1x раствор антибиотика/антимикотика, 1x добавку B27 или 1x N2 добавку в 500 мл флакона DMEM/F12 с добавкой L-глютамина, как описано выше.
- Чтобы приготовить 10 мМ (1000x) стокового раствора ингибитора рокиназы Y27632 (Y), добавьте 10 мг порошка в 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Отфильтровать, стерилизовать, аликотировать и хранить при температуре -20 °C. Использовать при рабочей концентрации 10 мкМ в среде.
- Чтобы приготовить 20 мМ (10 000x) стокового раствора SB431542, добавьте 10 мг порошка в 1,3 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Чтобы приготовить 2 мМ (1000x) стокового раствора DMH1, добавьте 10 мг порошка в 13,1 мл ДМСО. Отфильтровать, стерилизовать, аликотировать и хранить каждый раствор при температуре -20 °C. Использовать каждый раствор при рабочей концентрации 2 мкМ в среде (NM + SB431542 + DMH1).
заметка: Этот протокол рекомендует рабочие концентрации 2 мкМ как SB431542, так и ДМГ1, основываясь на наших наблюдениях и сообщениях других специалистов, утверждающих, что эта концентрация эффективно способствует нервной индукции от ПСК. Также сообщалось о более высоких концентрациях30. Кроме того, при использовании альтернативных сред также было показано, что малые молекулы не являются необходимыми для высокой нейронной конверсии. Таким образом, рабочие концентрации будут варьироваться в зависимости от альтернативных сред для клеточных культур, и оптимальные концентрации должны быть проверены отдельными исследователями.
- Для приготовления индивидуальных 100 мкг/мл (10 000x) стоковых растворов эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста фибробластов-2 (FGF2) добавьте по 1 мг каждого из них в 10 мл PBS + 0,1% BSA. Аликвоты EGF и FGF2 храните в щелочных растворах объемом 50 мкл и храните при температуре -80 °C. Используйте каждый из них в рабочей концентрации 10 нг/мл в среде; Например, добавьте 5 мкл EGF и 5 мкл FGF2 к 50 мл NM (NM + EGF + FGF2).
- Для приготовления стокового раствора доксициклина гидрохлорида (Dox) сначала растворить порошок в ДМСО до 100 мг/мл и хранить при температуре -20 °С. Затем разведите его до получения исходного раствора 2 мг/мл (1000x) в PBS и храните при -20 °C. Используйте при рабочей концентрации 2 мкг/мл в среде; Например, добавьте 50 мкл Dox к 50 мл NM (NM + Dox).
заметка: Не замораживайте растворы повторно после размораживания.
2. Генерация нейронных подтипов из индуцированных плюрипотентных клеток человека (hPSCs)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры следует хранить в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Эти культуры поддерживаются на комнатном уровне кислорода, хотя могут использоваться и более низкие уровни.
- Создание и поддержание предшественников астроцитов (hAstros) из hPSCs.
заметка: В этом разделе представлен краткий и упрощенный протокол дифференциации. Подробное описание (с формированием эмбриоидного тельца, выбором розетки и этапами регионального моделирования) см. в ранее описанном протоколе (рисунок 1A, пунктирная зеленая рамка).
- Затравочные кластеры hPSCs (рис. 1B) на 6-луночные планшеты с покрытием ECM (см. шаг 1.1) с 2 мл среды hPSC + Y на лунку. Кормите стволовые клетки каждый день до тех пор, пока они не сливаются примерно на 50% и не расщепляются по мере необходимости.
- Для расщепления hPSCs добавьте 1 мл пропускающего реагента в лунки и через 1 мин аспирацию. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин, добавьте 1 мл среды hPSC и разбейте агрегаты 1:10 на новые лунки с покрытием ECM в 2 мл среды hPSC + Y на лунку.
- Поддерживайте стволовые клетки до тех пор, пока они не станут примерно на 50% сливающимися, затем смените среду на NM + SB431542 + DMH1, чтобы вызвать нейронную дифференцировку (день 0). Когда клетки слияются примерно на 95%, разделите 1:6 на новые лунки с покрытием ECM в той же среде.
- На 14-й день диссоциируйте клетки с раствором отслойки и перенесите их в непокрытую колбу с буквой Y, чтобы способствовать образованию агрегатов.
заметка: Добавление Y используется для содействия выживанию клеток и образованию сфер, но не включается в каждую подкормку.
- Для генерации нейронных предшественников и нейронов (hNeurons) используйте эти клетки 14-го дня, как описано ниже. В качестве альтернативы можно использовать эти клетки в более поздние моменты времени из монослойных или сферических культур, прежде чем произойдет созревание нейронов или начнется глиогенез><.
заметка: По умолчанию этот протокол производит дорсально-кортикальные астроциты. Тем не менее, подтипы астроцитов могут быть регионально определены путем добавления моделирующих морфогенов, если это необходимо. Ретиноевая кислота (РА) может быть добавлена для каудализации клеток в фенотипы спинного мозга, в то время как звуковой еж (СЧГ), сглаженный агонист (САГ) или пурморфамин будут производить вентральные фенотипы.
- Для генерации предшественников астроцитов и астроцитов в спонтанно образующихся 3D-агрегатах (hAstrospheres) переключитесь на NM + EGF + FGF2 и подавайте их еженедельно (или по мере необходимости для обеспечения стабильного pH), как описано ранее.
- Аккуратно диссоциируйте агрегаты hAstro с помощью отслаивающего раствора при появлении темных центров и удалите сферы, которые спонтанно прикрепляются. Осторожно ломайте сферы раз в неделю, чтобы поддерживать их здоровье и избегать некротических ядер.
заметка: Не более 5 минут обработки раствором для отслойки.
- После 4-6 месяцев расширения подтвердите идентичность клетки и либо заморозьте в криоконсервирующем носителе (согласно инструкциям производителя), либо в альтернативных условиях хранения для длительного хранения в жидком азоте или немедленно используйте для экспериментов.
