$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
При проведении экспериментов были получены этические одобрения.
1. Клеточная культура и подготовка реагентов
- Подготовьте покрытые покрытием планшеты для культивирования клеток.
- Разбавьте раствор покрытия внеклеточного матрикса (ECM) средой Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco для получения исходного раствора в концентрации 1 мг/мл. Разбавленный исходный раствор ЭХМ разложить на 30 конических пробирок по 3 мл каждая и немедленно хранить при температуре -20 °С. Для получения рабочего раствора ресуспендируйте 3 мл заготовки ECM в 33 мл предварительно охлажденной среды DMEM/F12, доведя общий объем до 36 мл при концентрации 80 мкг/мл.
- Нанесите мазок 1 мл на лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток рабочим раствором ВКМ. Добавьте еще 1 мл DMEM/F12 в лунку (при необходимости), чтобы убедиться, что поверхность лунки полностью покрыта. Перед использованием 6-луночные планшеты для клеточных культур с покрытием постоять при комнатной температуре не менее 1 часа.
заметка: Пластины с покрытием можно хранить в инкубаторе или при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовьте составы сред, факторы роста и малые молекулы.
- Чтобы приготовить 500 мл среды для плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), добавьте 20x и 500x добавок в соответствии с инструкциями производителя.
- Чтобы приготовить 500 мл нейронной среды (NM), добавьте гепарин до конечной концентрации 2 мг/мл, 1x раствор антибиотика/антимикотика, 1x добавку B27 или 1x N2 добавку в 500 мл флакона DMEM/F12 с добавкой L-глютамина, как описано выше.
- Чтобы приготовить 10 мМ (1000x) стокового раствора ингибитора рокиназы Y27632 (Y), добавьте 10 мг порошка в 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Фильтр стерилизовать, аликотировать и хранить при температуре -20 °C. Использовать при рабочей концентрации 10 μМ в среде.
- Чтобы приготовить 20 мМ (10 000x) стокового раствора SB431542, добавьте 10 мг порошка в 1,3 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Чтобы приготовить 2 мМ (1000x) стокового раствора DMH1 (4-[6-(4-Изопропоксифенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]хинолин, 4-[6-[4-[4-(1-Метилэтокси)фенил]пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]-хинолин), добавьте 10 мг порошка в 13,1 мл ДМСО. Отфильтруйте стерилизуйте, аликотируйте и храните каждый раствор при температуре -20 °C. Используйте каждый раствор при рабочей концентрации 2 μМ в среде (NM + SB431542 + DMH1).
заметка: Этот протокол рекомендует рабочие концентрации 2 мкМ как SB431542, так и ДМГ1, основываясь на наших наблюдениях и сообщениях других организаций, утверждающих, что эта концентрация эффективно способствует нервной индукции от ПСК. Также сообщалось о более высоких концентрациях. Кроме того, при использовании альтернативных сред также было показано, что малые молекулы не являются необходимыми для высокой нейронной конверсии. Таким образом, рабочие концентрации будут варьироваться в зависимости от альтернативных сред для клеточных культур, и оптимальные концентрации должны быть проверены отдельными исследователями.
- Для приготовления стокового раствора доксициклина гидрохлорида (Dox) сначала растворить порошок в ДМСО до 100 мг/мл и хранить при температуре -20 °С. Далее разбавьте его до получения исходного раствора 2 мг/мл (1 000x) в PBS и храните при -20 °C. Используйте при рабочей концентрации 2 мкг/мл в среде; Например, добавьте 50 мкл Dox к 50 мл NM (NM + Dox).
заметка: Не замораживайте растворы повторно после размораживания.
2. Генерация нейронных подтипов из индуцированных плюрипотентных клеток человека (hPSCs)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные культуры следует хранить в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C. Эти культуры поддерживаются на комнатном уровне кислорода, хотя могут использоваться и более низкие уровни.
- Создание и поддержание предшественников астроцитов (hAstros) из hPSCs.
заметка: В этом разделе представлен краткий и упрощенный протокол дифференциации. (Рисунок 1А, пунктирная зеленая рамка).
- Затравочные кластеры hPSCs (рис. 1B) на 6-луночные планшеты с покрытием ECM с 2 мл среды hPSC + Y на лунку. Кормите стволовые клетки каждый день до тех пор, пока они не сливаются примерно на 50% и не расщепляются по мере необходимости.
- Для расщепления hPSCs добавьте 1 мл пропускающего реагента в лунки и через 1 мин аспирацию. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин, добавьте 1 мл среды hPSC и разбейте агрегаты 1:10 на новые лунки с покрытием ECM в 2 мл среды hPSC + Y на лунку.
- Поддерживайте стволовые клетки до тех пор, пока они не станут примерно на 50% сливающимися, затем смените среду на NM + SB431542 + DMH1, чтобы вызвать нейронную дифференцировку (день 0). Когда клетки слияются примерно на 95%, разделите 1:6 на новые лунки с покрытием ECM в той же среде.
- На 14-й день диссоциируйте клетки раствором отслойки и переложите в непокрытую колбу с Y, чтобы стимулировать образование агрегатов.
заметка: Добавление Y используется для содействия выживанию клеток и образованию сфер, но не включается в каждую подкормку.
- Для генерации нейронных предшественников и нейронов (hNeurons) используйте эти клетки 14-го дня для дифференцировки, как описано для трансгенных клеток.
- Генерация и поддержание индуцируемых нейронов (iNeurons) из hPSCs.
- Затравливайте трансгенные ПСК (со стабильным трансгеном, индуцируемым доксициклином, нейрогенином 2) на 6-луночных планшетах с покрытием ECM с 2 мл среды hPSC + Y на лунку (как описано выше для нетрансгенных линий). Ежедневно подавайте 2 мл среды на лунку, пока она не будет готова к подъему при 70% конфлюенции. Разделите ячейки, как описано выше.
- Когда клетки сливаются примерно на 35%, добавьте NM + Dox, чтобы вызвать дифференцировку в iNeurons.
заметка: Клетки превратятся в предшественников нейронов, но пока не будут распространять нейриты.
