Генерация 3D сфер совместного культивирования астроцитов и нейронов для индуцирования образования синапсов

Аннотация

Источник: Cvetkovic, C., et al. Моделирование синаптических микросхем с 3D-сокультурами астроцитов и нейронов из плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует процедуру совместного культивирования астроцитов и нейронов для формирования 3D-сфер. Эти 3D-сферы обеспечивают отдельную платформу для изучения формирования синапсов и интеграции нейронных сетей, тем самым выступая в качестве потенциальной модели для исследований в области нейробиологии развития, нейродегенеративных заболеваний и нейрофармакологических вмешательств.

Протокол

1. Подготовка и сопровождение 3D сферических культур

1. Диссоциация hAstros от 3D-агрегатов в суспензии.​
   1. Мягко диссоциируйте агрегаты астроцитов человека (hAstro) с помощью раствора отслойки при появлении темных центров и удалите сферы, которые спонтанно прикрепляются. Осторожно ломайте сферы раз в неделю, чтобы поддерживать их здоровье и избегать некротических ядер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 5 минут обработки раствором для отслойки.
2. Диссоциация hNeurons или iNeurons из 2D-монослоя.
   1. Удалите среду из 6-луночного планшета и добавьте 500 мкл раствора для отслойки в каждую лунку, содержащую монослойную культуру hNeuron (нейрон человека) или iNeurons (индуцируемые нейроны). Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут. Аккуратно добавьте 2-3 мл базальной среды DMEM/F12 для удаления прикрепленных клеток.
   2. Соберите клетки и среду в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 300 x g в течение 1 мин. Отсадите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл свежей среды и осторожно пипетируйте вверх и вниз с помощью микропипетки объемом 1 000 мкл, чтобы получить суспензию одиночных клеток.
3. Формируйте 3D-сферы с помощью микролуночных планшетов для культивирования.
   1. Подготовьте планшет, добавив 0,5 мл раствора для промывки, препятствующего прилипанию, в каждую лунку микролуночного планшета. Центрифуга при плотности 2 000 x g в течение 5 минут. Всасывайте раствор для полоскания, добавьте 1 мл базальной среды DMEM/F12 в каждую лунку для промывки и снова аспирируйте.
      заметка: Всегда следите за тем, чтобы центрифуга была сбалансирована во время использования.
   2. Подсчитайте каждый тип клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Добавьте желаемое соотношение диссоциированных hAstros и hNeurons или iNeurons к каждой лунке в общем объеме 2 мл нейронной среды (NM) + Y (включая Dox, если используются iNeurons). Центрифуга нагревается при давлении 100 x g в течение 3 мин и возвращается в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 24-луночные микролуночные планшеты (см. Таблицу материалов) содержат 300 микролунок на лунку. Добавьте минимум 6 x 10⁵ ячеек (для сфер 2 x 10^{по 3} ячейки каждая) и максимум 6 x 10⁶ ячеек (для сфер 2 x 10^{по 4} ячейки каждая) в 2 мл среды на лунку. Для жизнеспособных сфер с определенной плотностью в этом диапазоне используйте определенное количество ячеек и разделите на 300, чтобы вычислить количество ячеек на сферу. При желании также могут быть использованы альтернативные методы и инструменты формирования сфер. Следуйте инструкциям производителя в отношении допустимых диапазонов плотности ячеек.
   3. Позвольте клеткам самоорганизоваться в плотно упакованные сферы в микролуночных планшетах в течение следующих 2 дней (рисунок 1A). Замените 50% носителей, если культура желтеет.
      заметка: При извлечении и добавлении среды аккуратно заменяйте только половину носителя и пипетку, чтобы не повредить сферы. Сферы могут подниматься вверх из микроколодцев и сплавляться вместе с большей силой.
   4. Через 2 дня аккуратно извлеките шарики из микролунок с помощью микропипетки объемом 1 000 мкл (Рисунок 2D). Слегка приложите усилие к дну микролунок с фильтрующим материалом, чтобы удалить любые дополнительные прилипшие сферы. Дайте сферам осесть в конической трубке объемом 15 мл, отсадите старую среду и добавьте свежую среду.
4. Настройте систему биореактора для формирования 3D-сфер.​
   1. Очистите поверхность магнитной мешалки 70% этанолом и поместите ее в инкубатор для клеточных культур. Автоклав индивидуальных колб для стерилизации.
   2. Добавьте в каждую колбу сфер с минимальным содержанием фильтрующего материала 50–60 мл (рис. 2D, вставка). Поместите колбу на магнитную мешалку, установленную на 60 оборотов в минуту. Культивирование сфер в колбах до тех пор, пока они не будут готовы к сбору данных.
      заметка: Для формирования синапсов необходимо минимум 3 недели в культуре.

Результаты

Рисунок 1: Систематическая и воспроизводимая генерация биоинженерных 3D-нейронных сфер. (A) Микролуночные (μ-луночные) планшеты для культивирования используются для формирования трехмерных нейронных сфер желаемой плотности и соотношения нейронов и астроцитов систематическим и заданным пользователем образом, что дает постоянный размер и форму. Изображения демонстрируются через 1 день ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночная пластина	Научный центр Фишера	08-772-1Б
Конические тубы 15 мл	Olympus Plastics	28-101
Аккутаза	сигма	А6964-100МЛ	Решение для отслоения
Планшет AggreWell	Технологии стволовых клеток	No 34850 (Английский
Раствор для промывки, препятствующий прилипанию	Технологии стволовых клеток	7010	Предотвращение адгезии клеток к микролуночным планшетам
Анти/анти	Термофишер	15240062
В27	Термофишер	17504044	Приложение к СМИ
Нейронная среда BrainPhys	Технологии стволовых клеток	No 5790	Альтернатива нейрофизиологической базальной среде
DMEM/F12	Термофишер	10565-042 (Английский)	С добавкой GlutaMAX
ДМГ-1	Технологии стволовых клеток	73634	ОПАСНОСТЬ: Токсичен при проглатывании. Рабочая концентрация: 2 мкМ
Ослиная сыворотка	Биологические лаборатории Лампайр	7332100	Рабочая концентрация: 5% в первичном блокирующем буфере, 1% во вторичном блокирующем буфере
Доксициклина гидрохлорид (Dox)	сигма	Д3072-1мл	ОПАСНОСТЬ: Токсичен для беременных женщин. Рабочая концентрация: 2 мкг/мл
Эпидермальный фактор роста (EGF)	Пепротех	АФ-100-15	Рабочая концентрация: 10 нг/мл
Фактор роста фибробластов-2 (FGF)	Пепротех	100-18В	Рабочая концентрация: 10 нг/мл
Гемацитометр или автоматический счетчик ячеек	Технологии Life	AMQAX1000
Мембранная матрица Matrigel	Корнинг	354230 (Английский	Решение для нанесения покрытий ECM. Рабочая концентрация: 80 мкг/мл. Приготовьте на льду и убедитесь, что пипетки, пробирки и фильтрующий материал предварительно охлаждены.
Система MEA 2100	Многоканальные системы	MEA2100
Ингибитор рокиназы Y27632- (Y)	Токрис	1254	Рабочая концентрация: 10 мкМ
SB431542	Технологии стволовых клеток	72234	Рабочая концентрация: 2 мкМ
Фляги для спиннера	Научный центр Фишера	4500-125
Колба для культур T25	Olympus Plastics	25-207	Вентилируемые колпачки
Трипан синий	Инвитроген	Т10282

) ) г.