Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Приготовление культур МСК крыс
- Забор МСК из бедренной кости
- Автоклавируйте все инструменты для препарирования (т. е. тонкие ножницы для препарирования, ножницы с тупым наконечником и зубчатые щипцы) при температуре 180 °C в течение не менее 2 часов перед использованием.
- Готовят питательную среду МСК, состоящую из минимально эссенциальной среды - альфа-модификации (αMEM) с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллина/стрептомицина (P/S, 1% v/v).
- Принесите в жертву молодых самцов крыс Sprague Dawley (200-250 г массы тела) путем передозировки пентобарбитона (240 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно).
заметка: Образцы костного мозга от разных крыс следует обрабатывать отдельно.
- Поместите принесенных в жертву животных в лежачее положение. Тщательно очистите живот и нижние конечности 70% этанолом.
- Удалите кожу и подкожную клетчатку над медиальными бедрами с помощью тонких препарирующих ножниц и щипцов. Удалите мышцы бедра по окружности, пока бедренная кость не обнажится. Продолжайте делать это проксимально и дистально до тех пор, пока не будут видны коленные и тазобедренные суставы. Расчлените бедренную кость через тазобедренный и коленный сустав с помощью ножниц с тупым концом.
заметка: На этом этапе не разрезывайте бедренную кость, чтобы обнажить полость костного мозга. Перенесите неповрежденные бедренные кости в колпак для культуры тканей с ламинарным потоком для дальнейшей обработки.
- С помощью режущих ножниц с тупым концом проведите дистальный и проксимальный концы бедренной кости через метафиз.
- Поместите клеточное сетчатое фильтр 70 μм на коническую трубку объемом 50 мл. Введите шприц объемом 21 г, 10 мл, содержащий фосфатно-солевой буфер (PBS, 10 мМ Na2HPO4, pH 7,4) в обнаженный бедренный канал и промойте содержимое костного мозга в коническую трубку путем многократной промывки.
заметка: Примерно 20 мл PBS используется для промывки каждой бедренной кости. Если цвет покрасневшего содержимого остается кровавым и мутным, можно использовать больший объем.
- Соберите клетки центрифугированием при 480 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл питательной среды MSC. Поместите клетки на 10-сантиметровую чашку для культуры тканей. Поместите чашки для тканевых культур в клеточный инкубатор (37 °C, 5%CO2). Запишите начальный день нанесения покрытия как день 0.
заметка: На всех этапах, связанных с центрифугированием, установите тормоз для максимального замедления.
- Создание и расширение колоний MSC
заметка: Этот протокол основан на пластическом прилегании культуры тканей к выбранным МСК из полости костного мозга. Содержимое костного мозга позволяет прилипнуть к ткани культуры пластики в течение 2 суток.
- На 2-й день трижды промойте культуральные планшеты 10 мл PBS для удаления неадгезивных клеток. Замените PBS 10 мл питательной среды MSC после промывания. Промойте клетки PBS и пополняйте их питательной средой MSC каждые 3 дня.
заметка: Колонии МСК должны быть видны на 6-7 день (Рисунок 1A).
- Пропустите клетки к 10-му дню, удалив питательную среду и промыв клетки PBS. Добавьте 1,5 мл рекомбинантного реагента для диссоциации ферментативных клеток и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. Добавьте 3 мл питательной среды MSC для нейтрализации реакции. Оторвавшиеся клетки соберите центрифугированием при давлении 250 x g в течение 5 минут.
- Количественное определение клеток в грануле с помощью гемоцитометра после соответствующего разведения в PBS.
- Семена пропускают клетки с плотностью 40 000 клеток/см2 в 10-сантиметровую культуральную пластину в питательной среде МСК.
заметка: МСК крыс должны достичь 80-90% слияния в течение 2 дней после пассации (Рисунок 1B). Клетки могут быть пройдены, как описано в шаге 1.2.2, до 8 проходов. МСК можно охарактеризовать с помощью иммуноцитохимии и их способности к трехлинейной дифференцировке (рис. 2). Только культуры МСК между пассажами 3 и 8 подвергаются последующему гипоксическому прекондиционированию и обогащению нейронных предшественников. МСК с большим числом пассажей имеют уплощенную морфологию (рис. 1C) и не производят достаточного количества нейронных предшественников. От этих культур следует отказаться.
2. Подготовка культур BMSC человека
- Разведите 1 мл аспирата костного мозга человека с 9 мл питательной среды MSC и поместите клетки на 10-сантиметровую чашку для культуры тканей. Культуры следует хранить в клеточном инкубаторе (37 °C, 5%CO2).
- Удалите среду через 2 дня и осторожно промойте культуры трижды 10 мл PBS для удаления неадгезивных клеток. После окончательного промывки удалите PBS и замените его 10 мл питательной среды MSC. Пополняйте питательную среду после каждых 3 дней культуры после промывки PBS.
заметка: Колонии MSC должны быть видны на 6-7 день. Количество колоний может варьироваться в зависимости от субъекта.
- Проходите клетки на 10 день, как описано в пункте 1.2.2. Количественное определение клеток в грануле с помощью гемоцитометра после соответствующего разведения в PBS. Высейте пройденные клетки с плотностью 40 000 клеток/см2 на культуральную пластину диаметром 10 см в питательную среду МСК.
заметка: МСК человека (рис. 1D) демонстрируют морфологию, сходную с МСК крыс, и должны достигать 80-90% слияния в течение 2 дней после пассажа. Они должны быть охарактеризованы с помощью иммуноцитохимии и их способности к трехлинейной дифференцировке. Как и в случае с МСК крыс, человеческие МСК между пассажами 3 и 8 подвергаются последующему гипоксическому прекондиционированию и обогащению нейронных предшественников.
3. Гипоксическое предварительное кондиционирование
- Разберите компоненты камеры гипоксии (т.е. основание, крышку, лотки) после отпускания кольцевого зажима и очистите отдельные детали 70% этанолом. Поместите компоненты камеры в шкаф для культуры тканей с ламинарным потоком для стерилизации под ультрафиолетовым светом на 15 минут.
- Перед предварительным гипоксическим кондиционированием удалите среду и промойте культуры МСК крысы и человека (разделы 1 и 2) 10 мл PBS. Замените PBS на 10 мл питательной среды MSC с добавлением 25 мМ HEPES.
заметка: МСК, культивируемые на 10-сантиметровых посудах, должны были достичь 80-90% конфлюенции, прежде чем их подвергнут гипоксическому предварительному кондиционированию.
- Поместите чашки для культуры в камеру гипоксии. Соберите компоненты камеры и затяните кольцевой зажим. Продуйте газовую смесь 99% N2/1% O2 в камеру со скоростью потока 10 л/мин в течение 5 мин.
- Загерметизируйте соединительные концы камеры гипоксии, чтобы обеспечить отсутствие утечки газа. Поместите камеру внутрь клеточного инкубатора (37 °C, 5%CO2) на 16 часов.
- По завершении гипоксического прекондиционирования культуры извлекают из камеры для подготовки к последующей культуре обогащения нейронных предшественников.
4. Культура обогащения нейронных предшественников
- Приготовьте нейропрогениторную среду, состоящую из модифицированной орлиной среды Дульбекко/питательной смеси Хама F12 (DMEM/F12) с добавлением B27 (2% v/v), основного фактора роста фибробластов (bFGF, 20 нг/мл), эпидермального фактора роста (EGF, 20 нг/мл) и P/S (1% v/v).
- Отсоедините гипоксические предварительно кондиционированные МСК крысы/человека, как описано в шаге 1.2.2. Оторвавшиеся клетки соберите центрифугированием при давлении 250 x g в течение 5 минут. Количественное определение клеток в грануле с помощью гемоцитометра после соответствующего разведения в PBS.
- Ресуспендируйте клетки в нейральной прогениторной среде и семени на 6-луночных планшетах с низким прикреплением при плотности 6000 клеток/см2. Поместите культуру в клеточный инкубатор (37 °C, 5%CO2) на 12 дней. Восполняйте 75% нейропрогениторной среды каждые 3 дня.
заметка: Значительные неадгезивные клеточные кластеры должны наблюдаться к 6-7 дням. К 10-12 суткам можно наблюдать нейросферы диаметром ≥ 100 мкм (рис. 3). Гипоксические предварительно кондиционированные МСК должны давать больше нейросфер, чем МСК, культивируемые в нормоксических условиях.
- Соберите нейросферы на 12-й день, аспирировав их в пипетку объемом 10 мл и перенеся в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугирование нейросфер при 250 x g в течение 5 мин.<бр/>
заметка: Нейросферы можно охарактеризовать на 12-й день по нейральным маркерам-предшественникам, таким как нестин и GFAP.
5. Генерация шванновских клеток, подобных клеткам
- Приготовьте глиальную индукционную среду, состоящую из αMEM с добавлением β-герегулина (100 нг/мл), bFGF (10 нг/мл), тромбоцитарного фактора роста (PDGF-AA, 5 нг/мл), FBS (10%) и P/S (1% v/v).
- Подготовленные на участке 4 нейросферы отрубают в 6-луночных планшетах, покрытых PDL/ламинином, с плотностью 5-10 сфер насм2 в 1,5 мл глиальной индукционной среды на лунку. Заменяйте глиальную индукционную среду каждые 2 дня после промывки клеток PBS.
заметка: Видно, что клетки из засеянных нейросфер мигрируют наружу на 2-й день. К 7-му дню мигрирующие клетки имеют сужающийся вид и должны продемонстрировать иммуноположительную способность к маркерам шванновских клеток p75 нейротрофинового рецептора (p75) и S100β. Эти клетки называются МРЛ.
