Генерация шванновских клеток, совершенных судьбой, путем кокультуры с нейронами DRG
1. Подготовка очищенных нейронов DRG крысы
- Автоклавируйте все инструменты для пресечения (т.е. ножницы для рассечения, щипцы, два микродиссекционных щипца и ножницы для микродиссекции) при температуре 180 °C в течение не менее 2 часов перед использованием.
- Покройте 6-луночные тканевые культуральные планшеты поли-D-лизином (PDL, 10 мкг/мл в PBS) при температуре 4°C в течение ночи. Удалите PDL и промойте 1,5 м PBS на лунку.
- Продолжайте покрытие пластин ламинином (10 мкг/мл в PBS) при 37 °C в течение 2 ч. Промойте пластины 1,5 мл PBS на лунку.
- Приготовьте среду для поддержания нейронов DRG, состоящую из нейробазальной среды с добавлением B27 (2% v/v), L-глутамина (1% v/v), фактора роста нервов (NGF, 20 нг/мл) и пенициллина/стрептомицина (P/S, 1% v/v).
- Приготовьте среду для очистки нейронов DRG, состоящую из нейробазальной среды с добавлением B27 (2% v/v), L-глутамина (1%), фактора роста нервов (NGF, 20 нг/мл), p/s (1%), фтордезоксиуридина (FDU, 10 мкг/мл) и уридина (10 мкг/мл).
- Умерните беременных крыс на 14-15-е сутки беременности путем передозировки пентобарбитала (240 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно).
- Поместите принесенных в жертву животных в лежачее положение. Тщательно очистите брюшную полость с помощью 70% этанола.
- Разрежьте нижнюю брюшную стенку животного в продольном направлении с помощью тонких рассекательных ножниц и щипцов. Определите и удалите матку с помощью ножниц для рассечения. Разрежьте стенку матки, чтобы обнажить и извлечь эмбрионы. Перенесите эмбрионы в стерильную 10-сантиметровую чашку для культивирования, наполненную PBS. Поставьте тарелку для культуры на лед.
- Перенесите эмбрион, предназначенный для вскрытия, в стерильную 10-сантиметровую чашку для культивирования, заполненную PBS (комнатной температуры), и поместите ее под микроскоп для вскрытия. Приведите эмбрион в положение лежа.
заметка: Беловатый спинной мозг и прикрепленные к нему DRG можно увидеть над дорсальной стороной эмбриона, через его полупрозрачную кожу.
- Вставьте микрорассекающие щипцы по обе стороны спинного мозга и используйте тупое рассечение, чтобы начать отделение спинного мозга от окружающих мягких тканей. Отрежьте спинной мозг от животного с помощью микрорассекающих щипцов вдоль шейного отверстия и хвостового отрезка. Выполните дальнейшее тупое рассечение над вентральной стороной спинного мозга, чтобы освободить его от окружающих мягких тканей.
- Используйте микрорассекающие щипцы для удаления остатков мягких тканей над дорсальной стороной освобожденного спинного мозга.
заметка: На этом этапе должны остаться только спинной мозг, нервные корешки и прикрепленные ДРГ.
- Отделите отдельные DRG от соединяющих их нервных корешков с помощью микрорассекающих щипцов. С помощью ручки-дозатора, прикрепленной к наконечнику объемом 1 мл, перенесите DRG в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую PBS.
заметка: На каждую пробирку объемом 1,5 мл можно вместить максимум 100 DRG.
- Центрифугируют DRG при давлении 250 x g в течение 5 мин и ресуспендируют их в рекомбинантном реагенте для ферментативной диссоциации клеток (200 мкл на пробирку). Инкубировать (37 °C, 5%CO2) в течение 10 минут. Центрифугируйте DRG при давлении 250 x g в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в среду для поддержания нейронов DRG. Диссоциируйте гранулу путем осторожного растирания с помощью наконечника для дозатора объемом 200 мкл. Количественное определение клеток в грануле с помощью гемоцитометра после соответствующего разведения.
- Засейте клетки с плотностью 5000 клеток/см2 в 6-луночные планшеты, покрытые PDL/ламинином, в 1,5 мл среды для поддержания нейронов DRG на лунку. После двух дней культивирования удалите среду для поддержания нейронов DRG, промойте PBS и замените средой для очистки нейронов DRG.
заметка: Для каждого цикла очистки культуры DRG обрабатывают очистительной средой в течение 2 суток с последующей инкубацией в 1 сутки в поддерживающей среде. После 3-4 циклов очищения ожидается удаление всей эндогенной глии. Это должно занять примерно 14 дней. Очищенные культуры дают положительный результат на нейрональный маркер TUJ1 и отсутствуют на экспрессию S100β (рис. 1).
2. Генерация шванновских клеток, подобных клеткам
- Приготовьте глиальную индукционную среду, состоящую из αMEM (Minimum essential medium Eagle (MEM), альфа-модификации) с добавлением β-герегулина (100 нг/мл), основного фактора роста фибробластов (bFGF, 10 нг/мл), тромбоцитарного фактора роста (PDGF-AA, 5 нг/мл), фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%) и P/S (1% v/v).
- Нейросферы, приготовленные в разделе 4, отрубают 6-луночными планшетами, покрытыми PDL/ламинином, с плотностью 5-10 сфер на см2 в 1,5 мл глиальной индукционной среды на лунку. Заменяйте глиальную индукционную среду каждые 2 дня после промывки клеток PBS.
- Примечание: Видно, что клетки из засеянных нейросфер мигрируют наружу на 2-й день. К 7-му дню миграционные клетки имеют сужающийся вид и должны продемонстрировать иммуноположительную активность в отношении маркеров шванновских клеток p75 нейротрофинового рецептора (p75) и S100β7. Эти клетки называются МРЛ.
3. Кокультура МРЛ с нейронами DRG
- Приготовьте среду для кокультуры, состоящую из среды для поддержания нейронов DRG (шаг 1.1.4) и среды для глиальной индукции (шаг 1.2.1) в соотношении объем к объему 1:1.
- Приготовьте среду для поддержания шванновских клеток, состоящую из модифицированной смеси F-12/питательных веществ F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco с добавлением FBS (5%), β-герегулина (10 нг/мл) и P/S (1% v/v).
- Удалите питательную среду из МРЛ на 7-й день, промойте их PBS и инкубируйте с 0,5 мл/лунку рекомбинантного реагента для диссоциации ферментативных клеток при 37 °C в течение 5 мин. Повторно суспендируйте МРЛ в кокультурной среде.
- Количественное определение клеток с помощью гемоцитометра после соответствующего разведения.
- Засейте МРЛ на очищенные культуры нейронов DRG с плотностью 1000 клеток/см2. Выдерживайте кокультуры в течение 14 дней, с заменой среды каждые 2 дня.
заметка: В ходе кокультивирования МРЛ приобрели веретенообразную морфологию, типичную для зрелых шванновских клеток (рис. 2). Эти клетки сохраняются в своем фенотипе после отмены факторов роста и способны миелинировать аксоны in vitro и in vivo. Положительный результат шванновских клеточных маркеров (т.е. p75 и S100β) следует контролировать с помощью иммунофлюоресценции.
- По завершению кокультуры, проходят совершенные судьбой шванновские клетки. Используйте 0,5 мл диссоциационного реагента на лунку. Количественное определение клеток с помощью гемоцитометра после соответствующего разведения.
