Метод in vitro для создания астроцитарных скаффолдов в гидрогелевых микроколонках

Аннотация

Источник: Katiyar, K. S., et al. Трехмерные тканевые инженерные выровненные сети астроцитов для повторения механизмов развития и облегчения регенерации нервной системы. J. vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод создания трехмерных астроцитарных скаффолдов в гидрогелевых микроколоннах. Внутренняя часть микроколонн покрыта коллагеном. Вводятся астроциты, которые прилипают к коллагену и при дальнейшей инкубации самособираются в трехмерный каркас.

Протокол

1. Разработка микроколонок с агарозным гидрогелем

1. Приготовьте раствор агарозы 3% по весу/объему (по массе), взвесив 3 г агарозы и переложив его в стерильную мензуру, содержащую 100 мл фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко (DPBS). Добавьте стерильный магнитный стержень в стакан и поместите его на поверхность горячей плиты/мешалки. Держите стакан накрытым, чтобы предотвратить испарение его содержимого на следующем этапе.
2. Нагрейте агарозу и DPBS при температуре 100 °C и перемешайте при 60-120 об/мин. При необходимости отрегулируйте эти настройки и постоянно следите за ходом процесса растворения по мере того, как раствор первоначально меняется от непрозрачного до прозрачного вида, указывающего на то, что агароза полностью растворилась.
   осторожность: Горячий стакан и раствор горячие!
3. Когда раствор агарозы нагревается и перемешивается, достаньте четыре пустые чашки Петри диаметром 10 см и добавьте в две из них 20 мл DPBS. Поместите иглы для иглоукалывания (диаметр: 300 мкм, длина: 40 мм), стеклянные микролитровые капиллярные трубки (диаметр: 701,04 мкм, длина: 65 мм, емкость: 25,0 мкл) и дозатор для колб внутрь шкафа биобезопасности. Когда жидкий раствор агарозы очистится, поддерживайте постоянный нагрев на уровне около 50 °C и помешивайте, чтобы избежать желатинообразования агарозы.
4. Введите акупунктурную иглу в нижнее отверстие дозатора для луковиц. Вставьте капиллярную трубку поверх иглы, открытой наружу. Закрепите капиллярную трубку, введя ее часть в резиновую секцию цилиндра дозатора ламп.
5. Перенесите 1 мл жидкой агарозы с помощью микропипетки на поверхность пустой чашки Петри и поместите один конец капиллярной трубки вертикально (с введенной иглой) в контакт с агарозой, в то время как резиновый колпачок дозатора для колб зажимается внутрь. Медленно ослабьте давление на колпачок дозатора для лампочки, чтобы втянуть агарозу в капиллярную трубку.
   заметка: Перенос жидкой агарозы в капиллярные трубки должен быть выполнен быстро. Если жидкую агарозу оставить остывать на поверхности чашки Петри на достаточное время (примерно 60 с), она начинает желить, препятствуя подходящему отсасыванию агарозы по капиллярной трубке.
6. Поместите каждую колбу-трубку-иглу в свободную чашку Петри и дайте агарозному гелю внутри капиллярных трубок застыть в течение 5 мин. Осторожно вытяните капиллярную трубку руками из резиновой пробки в цилиндре дозатора для колб, оставив иглу и агарозный гель на месте внутри трубки.
7. Вручную извлеките акупунктурную иглу, медленно вытягивая ее из капиллярной трубки; только что затвердевший агарозный цилиндр также выскальзывает из трубки во время этой процедуры, все еще окружая иглу. Аккуратно подтолкните микроколонку вдоль акупунктурной иглы кончиком стерильных щипцов, чтобы переместить ее до конца. Поместите иглу над открытой, содержащей DPBS чашкой Петри и протолкните микроколонку в DPBS с помощью щипцов.
   заметка: Если после удаления акупунктурной иглы микроколонна агарозы остается в пределах стеклянной капиллярной трубки, медленно вытолкните микроколонку агарозы из капиллярной трубки иглой калибра 25 мм в чашку с помощью DPBS.
8. Простерилизуйте микроскальпели или щипцы с помощью стерилизатора с горячими шариками. Изготовьте 4% мази агарозы, взвесив 4 г агарозы и переложив ее в 100 мл DPBS. Нагрейте и перемешайте, как описано в шаге 1.2, чтобы получить прозрачный 4% жидкий раствор агарозы. Поддерживайте нагрев и перемешивание раствора на протяжении следующих этапов.
9. Перенесите чашки Петри, содержащие микроколонны, в вытяжку для препарирования и переместите микроколонку с тонкими щипцами в пустую чашку Петри. Используйте стереоскоп для визуального контроля и микроскальпель, чтобы обрезать микроколонки до нужной длины. Обрежьте оба конца, чтобы сформировать скошенные концы под углом 45^° от горизонтали, чтобы облегчить работу с микроколонками во время внеклеточного матрикса (ВКМ) и добавления клеток.
10. Повторите предыдущий шаг еще для трех микроколонок в той же чашке Петри и выровняйте четыре конструкции параллельно с расстоянием <3 мм между каждым из цилиндров. Загрузите 50 мкл 4% раствора агарозы с помощью микропипетки и вылейте полосу/линию жидкости на массив микроколонн, чтобы соединить и связать конструкции в группы по четыре штуки (далее именуемые «лодочками микроколонн»). Избегайте смещения 4% агарозы к концам микроколонн, которые могут засорить внутреннюю часть, минимизируя расстояние между конструкциями и быстро добавляя агарозу тонкой линией.
    заметка: Для изготовления астроцитарных каркасов не требуется организовывать группы из четырех микроколонн в «лодки». Тем не менее, лодки служат для ускорения процесса изготовления и предлагают более безопасный способ перемещения и обработки микроколонн на последующих этапах.
11. Дайте лодке с микроколонной остыть в течение 1-2 минут, чтобы дать возможность загустеть добавленной 4% агарозы. Подхватите лодочку для микроколонн с помощью тонких щипцов с помощью соединительной 4% агарозы и переместите микроколонны к другой чашке Петри, содержащей DPBS, приготовленной на шаге 1.1.3. По желанию изготовьте больше лодок с оставшимися микроколоннами.
12. Переместите чашки Петри, содержащие микроколонны и/или лодочки, в шкаф биобезопасности и стерилизуйте под воздействием ультрафиолетового (УФ) света в течение 30 мин.<бр/> осторожность: Носите соответствующую защиту, чтобы предотвратить воздействие ультрафиолета.
13. Хранить тарелки с микроколонными лодочками в DPBS при температуре 4 °C, если добавление ЭХМ и покрытие ячеек не произойдет сразу после этого, до 1 недели. Повторите шаги изготовления микроколонок, если конструкции не используются в течение этого периода времени.

2. Первичная клеточная культура и выделение

1. Выделение кортикальных астроцитов от детенышей крыс
   1. Готовясь к следующим шагам, добавьте 20 мл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) в четыре чашки Петри диаметром 10 см, которые будут служить резервуарами для рассеченных тканей. Держите всю посуду на льду. Простерилизуйте чистые хирургические ножницы, щипцы, микрошпатель и микроскальпель в стерилизаторе с горячими шариками.
   2. Предварительно подогрейте 0,25% трипсин с 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и 0,15 мг/мл дезоксирибонуклеазы (ДНазы) I в ГБСС при 37 °С. Кроме того, предварительно нагрейте среду для культивирования астроцитов до 37 °C, которая состоит из модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) со смесью питательных веществ F-12 от Ham и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).
   3. Обезболите детенышей крыс Спрэг-Доули в послеродовой день 0 или день 1, подвергнув их гипотермическим условиям, и усыпьте путем обезглавливания. Приколите голову в стадию с помощью иглы калибра 19 мм, помещенной в морду перед глазами.
   4. Сделайте разрез скальпелем посередине сзади вперед, от основания шеи до сразу за глазами. Проведите еще один разрез, идущий в сторону непосредственно за глазами вниз, формируя Т-образную форму. С помощью тонких щипцов оттяните черепную кожу/череп в сторону.
   5. Держите голову за морду (лицом вверх), поместив один зубец щипцов в рот животного, а другой на внешнюю поверхность. Извлеките мозг с помощью стерильного микрошпателя и поместите его в одну из чашек Петри, наполненных охлажденным HBSS. Сразу после этого положите эту чашку Петри на лед и всегда, за исключением случаев, когда она используется.
   6. Поместите гранитный блок, ранее хранившийся при температуре -20 °C, ниже стереоскопа внутри вытяжного колпака. Поместите чашку Петри с тканями мозга на поверхность гранитной глыбы, чтобы сохранить ее низкую температуру во время процедуры рассечения. Используйте стереоскоп в качестве визуального ориентира на следующих этапах.
   7. Если обонятельные луковицы остались неповрежденными, извлеките их, разрезав щипцами или микроскальпелями. Кроме того, с помощью микроскальпеля удалите мозжечок и сделайте разрез по средней линии, разделяющий два полушария головного мозга. Перенесите полушария с помощью щипцов в чашку Петри, содержащую свежий охлажденный HBSS.
   8. Рассеките структуры среднего мозга изнутри полушарий с помощью микроскальпеля, чтобы получить только разделенные коры головного мозга. С помощью тонких щипцов отклейте мозговые оболочки, листовидную структуру, от кортикальной ткани и перенесите изолированные мозговые оболочки в новую чашку Петри с холодным HBSS. Используйте микроскальпель для измельчения ткани, чтобы увеличить площадь поверхности для действия трипсина на следующем этапе.
   9. С помощью пипетки Пастера перенесите кору головного мозга в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл предварительно подогретого трипсина-ЭДТА (по 8 коры в каждой пробирке). Подвергайте кортикальную ткань воздействию трипсина-ЭДТА в течение 5-7 минут при 37 °C.
   10. С помощью пипетки Пастера осторожно извлеките трипсин-ЭДТА и добавьте в пробирку центрифуги 400 мкл 0,15 мг/мл раствора ДНКазы I. Помешивайте трубку или вихрь до тех пор, пока вся ткань не будет диссоциирована и в жидкости не останется кусочков ткани. Если полностью растворить ткань не удается, удалите оставшиеся фрагменты кончиком пастеровской пипетки.
   11. Центрифугируйте пробирку, содержащую диссоциированный клеточный раствор, при температуре 200 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пастеровской пипетки, не повреждая клетки. Добавьте 1 мл питательной среды для астроцитов (определено на шаге 2.1.2) в пробирку с помощью микропипетки и перемешайте для получения ресуспендии и получения однородного раствора.
   12. Перенесите 10 мл среды для культивирования астроцитов с помощью серологической пипетки в колбу Т-75. Добавьте 250 мкл клеточного раствора объемом 1 мл (приготовленного на шаге 2.1.11) с помощью микропипетки в колбу, чтобы в каждой колбе было выложено количество клеток в мозг одного птенца. Равномерно распределите выгруженный раствор ячейки по питательной среде и осторожно перемешайте колбу для дальнейшего равномерного распределения.
   13. Культивировать покрытые колбы в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °С и 5%_СО2. После достижения 24 и 72 ч в культуре механически перемешайте колбу, чтобы отделить неадгезивные типы клеток, такие как нейроны и олигодендроциты.
   14. После этого, в каждой из этих временных точек, выполните смену носителя. Держите колбу вертикально, чтобы питательная среда лежала на дне колбы, не закрывая прилипшие клетки. Отсасывайте питательную среду с помощью пастеровской пипетки, прижимая кончик пипетки к нижнему углу колбы, чтобы избежать извлечения клеток. Поместите колбу в исходное горизонтальное положение и аккуратно добавьте 10 мл астроцитарной среды на клетки с помощью серологической пипетки.
   15. Возвращайте колбы в инкубатор после каждой смены среды. После достижения 90% конфлюенции еще раз механически перемешайте колбу, чтобы удалить все оставшиеся неадгезивные клетки.
   16. Проведите через астроциты, вынув питательную среду с помощью вакуума и пипетки Пастера. Добавьте 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА с помощью серологической пипетки поверх прикрепленных клеток. Осторожно перемешайте колбу, чтобы убедиться, что трипсин покрывает все клетки, и инкубируйте колбу в течение 5-7 минут при 37 °C и 5%_CO2.
   17. Угасить трипсин путем добавления 1 мл астроцитарной среды в клетки с помощью серологической пипетки. Извлеките клеточный раствор из колбы с помощью серологической пипетки и переложите его в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при плотности 200 x g в течение 3 минут.
   18. Надосадочную жидкость удалить серологической пипеткой и повторно суспендировать в 1 мл питательной среды для астроцитов. Перемешивайте пробирку, чтобы убедиться, что клеточный раствор однороден. Подсчитайте количество клеток в растворе с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
       заметка: Колба, которая на 90% сливается, обычно дает около 3 миллионов астроцитов.
   19. Добавьте 10 мл среды для культивирования астроцитов в колбу Т-75. Проводят разведение в соотношении 1:4 путем переноса 250 мкл клеточного раствора (шаг 2.1.18) с помощью микропипетки в колбу Т-75, уже содержащую питательную среду. Осторожно перемешивайте, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по всей поверхности колбы.
   20. Повторяйте шаги 2.1.16-2.1.19 каждый раз, когда достигается 90% слияние для прохождения ячеек.
2. Выделение корковых нейронов из плодов крыс
   1. Следуйте препаратам, аналогичным шагам 2.1.1 и 2.1.2, за исключением того, что предварительно подогретая среда представляет собой кокультуральную среду, состоящую из нейробазальной среды + 2% добавки B-27 (для нейронов) + 1% безсывороточной добавки G-5 (для астроцитов) + 0,25% L-глутамина.
   2. Усыпить беременных на 18-й день беременности крыс Спрэг-Доули с помощью удушья углекислым газом и подтвердить смерть путем обезглавливания.
   3. Извлеките зародыши крысы и отделите кору головного мозга от остальной мозговой ткани в чашках Петри, содержащих HBSS на поверхности охлажденного гранитного блока, используя стереоскоп для визуального наведения и стерилизованные ножницы, микроскальпель и щипцы. После последовательного препарирования головы, мозга, полушарий головного мозга и коры головного мозга перенесите каждую ткань в новую чашку Петри, заполненную HBSS.
   4. Измельчите корковую ткань на более мелкие фрагменты, чтобы увеличить площадь поверхности для трипсина. Перенесите 4-6 кортикальных клеток с помощью пипетки Пастера в пробирку с 5 мл предварительно подогретого трипсина-ЭДТА и поддерживайте при температуре 37 °C для диссоциации ткани. Через 5-7 мин вручную перемешайте трубку и не допускайте слипания ткани.
   5. Снимите трубку с 37 °C через 10 минут. Как объяснялось ранее на шаге 2.1, извлеките трипсин-ЭДТА и замените его 1,8 мл 0,15 мг/мл раствора ДНКазы. После этого переведите ткань в вихрь до тех пор, пока раствор не станет однородным, без фрагментов ткани, плавающих в жидкости.
   6. Центрифугируйте диссоциированный тканевый раствор при 200 х г в течение 3 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендировать в 2 мл среды для совместного культивирования. Подсчитайте количество клеток в этом растворе с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
      заметка: Обычный выход составляет 3,0-5,0 x 10⁶ клеток/корковое полушарие.
   7. Приготовьте новый клеточный раствор с плотностью 2,0-4,0 x 10⁵ клеток/мл в среде совместного культивирования, определенной выше.

3. Развитие астроцитарных кабелей внутри микроколонок

1. Изготовление ядра ECM
   ПРИМЕЧАНИЕ: ECM должен быть добавлен внутрь гидрогелевых микроколонок в тот же день, когда будет выполнен посев клеток.
   1. В шкафу биобезопасности приготовьте раствор коллагена типа I типа «крысиный хвост» в концентрации 1 мг/мл в среде для совместного культивирования в стерильной микроцентрифужной пробирке. Держите микроцентрифужную пробирку с раствором ECM на льду все время, за исключением периода использования.
   2. Перенесите 1-2 мкл раствора ЭХМ с помощью микропипетки на полоску лакмусовой бумаги для оценки его pH. Добавьте 1 мкл 1 Н гидроксида натрия (NaOH) или соляной кислоты (HCl) в микропипетку для увеличения или уменьшения pH раствора ECM соответственно и делайте пипетку вверх и вниз для гомогенизации. Проверьте новый pH с помощью полоски лакмусовой бумаги и добавьте еще кислоты или щелочи, по мере необходимости, до тех пор, пока pH не станет стабильным в диапазоне 7,2-7,4.
   3. Переместите чашки Петри с шага 1.2 на рассекционный колпак, а 4-5 микроколонок или лодочку со стерильными тонкими щипцами перенесите в пустую стерильную чашку Петри диаметром 35 или 60 мм. Используя стереоскоп для наведения, поместите наконечник микропипетки объемом 10 мкл на одном конце каждой микроколонки и отсосите, чтобы освободить просвет от DPBS и пузырьков воздуха. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха с помощью стереоскопа, чтобы убедиться, что ЭКМ, добавленный на следующем этапе, может свободно течь по просвету.
   4. Зарядите микропипетку P10 раствором ЭХМ, приложите наконечник объемом 10 мкл к одному концу гидрогелевых микроколонок и подайте достаточно раствора для заполнения просвета (примерно 3-5 мкл), наблюдая за входом ЭКМ с помощью стереоскопа. Пипетируйте небольшой резервуар (2-4 мкл) раствора ECM на обоих концах микроколонки.
      заметка: Всегда управляйте 4-5 микроколоннами или одной лодкой за раз, чтобы предотвратить длительное высыхание конструкций, так как это может привести к деформации конструкции микроколонны. Полностью высушенные микроколонны прочно прикрепляются к поверхности чашек Петри, что препятствует их утилизации для засева клеток. Чрезмерное количество сокультуриваемых сред (в качестве меры гидратации) не может быть добавлено в микроколонки, поскольку это может привести к вытеканию ВКМ в течение инкубационного периода, описанного ниже.
   5. Пипетки для совместного культивирования сред в кольце вокруг чашки Петри, чтобы обеспечить сток влажности и предотвратить высыхание колонок во время инкубации. Инкубируйте чашку Петри, содержащую микроколонки, содержащие ECM, при 37 °C и 5%_CO2 в течение 1 ч, чтобы стимулировать полимеризацию коллагена перед добавлением нейронов и/или астроцитов><. заметка: ЭКМ должен образовывать слой, покрывающий внутреннюю поверхность полого просвета, а не твердое ядро ЭХМ, охватывающее внутреннюю часть, что можно наблюдать с помощью стереоскопа. Если ECM образует сердцевину, продолжайте инкубационный период до тех пор, пока не останется только слой. С образованием этого слоя раствор астроцитарной клетки может заполнить внутреннюю часть микроколонны на этапах гальванического покрытия.
   6. В течение инкубационного периода приготовьте раствор для клеток астроцитов (как описано ниже).
2. Посев астроцитов и нейронов в микроколонках
   1. Пропустите покрытые астроциты (между четвертым и двенадцатым пассажем), как описано в шагах 2.1.16-2.1.19. После подсчета количества клеток в колбе готовят клеточный раствор плотностью 9,0-12,0 х 10⁵ клеток/мл раствора, суспензированного в клеточно-культуральных средах.
   2. С помощью стереоскопа поместите наконечник микропипетки P10 на один конец микроколонок и перенесите достаточное количество клеточного раствора (~5 мкл) в просвет для его полного заполнения. Как было сделано выше с помощью ВКМ, добавьте небольшие резервуары с раствором клеток на оба конца каждого микростолбика.
   3. Инкубируйте покрытые микроколонки на чашках Петри при 37 °C и 5%_CO2 в течение 1 ч, чтобы способствовать прикреплению астроцитов к ECM. Если нейроны не будут добавляться в микроколонки, переходите к шагу 3.2.5.
   4. После начального инкубационного периода добавьте 1-2 мкл раствора коркового нейрона, полученного на шаге 2.2.7, в оба конца микроколонок с помощью микропипетки, наблюдая под стереоскопом. Убедитесь, что в чашках присутствует достаточное количество среды, чтобы избежать высыхания, и снова инкубируйте в течение 40 минут при 37 °C и 5%_CO2, чтобы обеспечить адгезию нейронов.
      заметка: Раствор корковых нейронов также можно добавить через 1-2 дня после формирования пучка, выполнив шаг 3.2.4 после тщательного извлечения питательных сред из чашки Петри с помощью микропипетки.
   5. После инкубационного периода тщательно заполните чашки Петри, содержащие покрытые микроколоннами, 3 или 6 мл сокультурных сред для 35 или 60 мм чашек Петри соответственно. Поддерживайте покрытые микроколонки в культуре при температуре 37 °C и 5%_CO2, чтобы способствовать самосборке выровненных астроцитарных пучков, которые должны образовать пучковую, кабелевидную структуру через 6-10 часов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Игла для иглоукалывания (диаметр 300 мкм)	Лхаса Медикал	ХС.30х40	Диаметр может варьироваться в зависимости от желаемого размера просвета микроколонны.
чашка Петри	рыбак	08772Б
Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (DPBS)	Инвитроген	14200075
Полистирольная одноразовая серологическая пипетка	рыбак	13-678-11Д
агароза	сигма	А9539-50Г
Микролитровая стеклянная капиллярная трубка (701 мкм)	рыбак	21-170Дж	Диаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера оболочки микроколонны.
Диспенсер для микроколб	рыбак	21-170Дж	Лампочка поставляется в комплекте с микроколпачковыми трубками.
Конфорка	рыбак	SP88857200
Магнитный стержень	рыбак	1451352
Микропипетка	сигма	Z683884-1 шт.
Игла калибра 25 мм	рыбак	14-826-49
Микроскальпель	Робоз Хирургический	РС-6270
ножницы	Инструменты для точной науки	14081-09
щипцы	Мировые прецизионные приборы	501985
Стерилизатор горячих шариков	сигма	Z378550-1 шт.
стереоскоп	Компания Nikon	SMZ800N
Микрошпатель	рыбак	С50821
Коллаген крысиного хвоста I типа	Корнинг	354236	Поддерживайте при температуре 4 ºC и снимайте только при необходимости. Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Микроцентрифужная пробирка	рыбак	Тел.: 02-681-256
Гидроксид натрия (NaOH)	рыбак	СС2661
Соляная кислота (HCl)	рыбак	СА48-1
лакмусовая бумага	рыбак	Тел.: 09-876-18
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Инвитроген	14170112	Хранить при температуре 4 ºC.
0,25% Трипсин-ЭДТА	Инвитроген	25200056	Перед использованием хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC.
Дезоксирибонуклеаза поджелудочной железы крупного рогатого скота (Dnase) I	сигма	10104159001	Перед использованием хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC.
Модифицированная среда Dulbecco Eagle Medium (DMEM) со смесью питательных веществ F-12 от Ham	Gibco	11330-032	Хранить при температуре 4 ºC.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Атланта Биолакс	С11195	Хранить при температуре -20ºC.
Послеродовой день 0 или день 1 Щенки крысы Sprague Dawley	Чарльз Ривер	Штамм 001
Базальная среда нейробазального эмбрионального нейрона	Инвитроген	21103049	Перед использованием хранить при температуре 4ºC и нагревать до 37 ºC.
B-27 пищевая добавка без сыворотки	Инвитроген	12587010	Перед использованием хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC.
L-глютамин	Инвитроген	35050061	Перед использованием хранить при температуре -20 ºC и нагревать до 37 ºC.
Астроцитарная добавка G5	Инвитроген	17503012
Sprague Dawley эмбриональный день 18 крыс	Чарльз Ривер	Штамм 001
Пастеровская пипетка	рыбак	22-042816 (Английский
Центрифужная пробирка 15 мл	ЭМЕСКО	1194-352099 (Английский)
вихрь	рыбак	Тел.: 02-215-414
центрифуга	рыбак	Тел.: 05-413-115
Гемоцитометр	рыбак	02-671-6 (английский
инкубатор	рыбак	13 998 076