Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка шелковых каркасов
- Приготовление шелкового раствора из коконов Bombyx mori
- Разрежьте каждый кокон на 8 равных частей с помощью ножниц. Используйте около 11 коконов на 5 г раздробленных коконов. (15 мин)
- Приготовьте 2 л раствора 0,02 M Na2CO3 и вскипятите с помощью горячей плиты. (15 мин)
- Взвесьте 5 г раздробленных коконов и отварите их в растворе Na2CO3 в течение 30 мин. Каждые пару минут помешивайте кипящий шелк лопаткой. Этот этап, называемый дегуммингом, очищает фиброин шелка от гидрофильных белков, серицинов. (30 мин)
- Отожмите фиброин вручную и промойте его в дистиллированной воде не менее трех раз, чтобы смыть остатки серицина и химических веществ. (5 мин)
- Поместите влажный фиброин на чашку Петри и высушите экстракт фиброина в проточном колпаке O/N.
- На следующий день взвесьте сухую массу фиброина и поместите фиброин в стеклянный стакан. (15 мин)
- Чтобы растворить фиброин в 9,3 М растворе LiBr, рассчитайте необходимый объем (в мл) LiBr, умножив массу сухого фиброина на 4. Медленно налейте раствор LiBr на фиброин шелка и с помощью шпателя погрузите все волокна фиброина. Накройте стакан крышкой, чтобы предотвратить испарение, и поместите его при температуре 60 °C на 4 часа, чтобы волокна растворились. (15 мин)
- С помощью шприца соберите раствор фиброина из стакана и загрузите его в диализные кассеты MWCO 3500. Проводить диализ против дистиллированной воды в течение 48 часов. Меняйте воду каждые пару часов.
- С помощью шприца соберите раствор фиброина из кассет в конические пробирки объемом 50 мл и дважды центрифугируйте при 9 000 об/мин (~ 12 700 x g) при 4 °C в течение 20 минут. После каждого этапа центрифугирования выливайте надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбрасывайте гранулы. (40 мин)
- Измерьте концентрацию фиброина, оценив сухой вес. Налейте 1 мл раствора шелка в лодку для взвешивания. Высушите образец в духовке при температуре 60 °C в течение 2 часов. Взвесьте сухой фиброин шелка и рассчитайте концентрацию раствора фиброина шелка, умножив полученную массу на 100. Ожидаемая концентрация раствора шелка составляет 6-9% (по массе).
- Отрегулируйте концентрацию шелка до 6% (по массе), разбавив его в дистиллированной воде.
Точка остановки: Жидкий шелковый фиброин можно хранить при температуре 4 °C до одного месяца в закрытом контейнере.
- Приготовление пористых каркасов из раствора шелка.
- Просейте гранулированный NaCl, чтобы отделить гранулы размером 500-600 мкм, которые будут использоваться на последующих этапах. Выбросьте гранулы размером от 500 μм до более 600 μм. (15 минут)
- Вылейте 30 мл 6% раствора шелка в форму из политетрафторэтилена (ПТФЭ) (рис. 1). Аккуратно рассыпьте по шелку 60 г просеянного NaCl. Постучите по емкости, чтобы получить равномерный слой соли. Инкубировать в течение 48 часов при RT для полимеризации шелка.
- Поместите форму, содержащую каркас из ПТФЭ, в печь при температуре 60 °C на 1 час для завершения полимеризации и испарения оставшейся жидкости.
- Поместите содержимое формы из ПТФЭ в стакан, содержащий 2 л дистиллированной воды, на 48 часов, чтобы выщелачивать соль. Меняйте воду 2-3 раза в день. Снимите губчатые леса с форм, когда соль полностью выщелачивается.
Пункт остановки: Губки можно хранить погруженными в воду при температуре 4 °C в закрытом контейнере, чтобы предотвратить обезвоживание скаффолдов.
- По готовности вырежьте каркасы с помощью биопсийного перфоратора диаметром 5 мм. Предварительно разрежьте леса так, чтобы они достигали примерно 2 мм в высоту. Выбейте центр каркаса с помощью биопсийного перфоратора диаметром 2 мм (Рисунок 2A). (1 час)
- Автоклав подмости погружают в воду для их стерилизации (влажный цикл, 121 °C, 20 мин).
Пункт остановки: Губки можно хранить погруженными в воду при температуре 4 °C в закрытом контейнере, чтобы предотвратить обезвоживание скаффолдов.
- Перед планируемым посевом клеток необходимо погрузить скаффолды в стерильный раствор поли-D-лизина (PDL) в дозе 0,1 мг/мл. Инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 °C.
- Промойте каркасы 3 раза фосфатно-соевым буфером (PBS) для удаления несвязанного PDL. (30 мин)
2. Выделение нейронов коры головного мозга крысы
- Препарируйте кору головного мозга у эмбрионов 18-го дня (E18) крыс Спрага-Доули после получения утвержденного протокола на животных. (2 часа)
- Инкубировать 10 коры головного мозга в 5 мл 0,25% трипсина с 0,3% ДНКазой I (из поджелудочной железы крупного рогатого скота) в течение 20 мин при 37 °С.
- Инактивируйте трипсин, добавив 1 мг/мл соевого белка.
- Растирайте кору головного мозга с помощью пипетки Пастера объемом 10 мл, пипетируя вверх и вниз 20 раз до получения одноклеточной суспензии. Будьте осторожны и избегайте образования пузырьков воздуха. (10 мин)
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 127 x g в течение 5 минут.
- Ресуспендировать клеточную гранулу в 10 мл питательной среды (нейробазальная среда, 1x добавка B27, 1x Глутамакс, 1% пенициллин/стрептомицин). Посчитайте клетки. Ожидаемая концентрация клеток составляет около 2x107/мл. (20 мин)
3. Сборка и культура конструирования
- Подмостной посев с ячейками
- Переместите стерильные каркасы и всю необходимую посуду внутрь колпака для клеточных культур. Поместите каркасы в 96-луночный планшет для культивирования клеток с помощью стерильных щипцов, выделив по одному каркасу на лунку. (10 мин)
- Погрузите каркасы в среду для культивирования клеток, чтобы уравновесить их перед посевом клеток. Инкубировать в течение 1 часа при 37 °C. (10 мин)
- Отсасывайте избыток среды из каркасов.
- Нанесите 100 мкл клеточной суспензии/скаффолда. (10 мин)
- Инкубируйте клетки при 37 °C O/N, чтобы обеспечить прикрепление клеток к каркасу.
- На следующее утро аспирируйте неприкрепленные клетки и нанесите 200 μл/лунку свежей питательной среды. (10 мин)
- Встраивание каркаса с коллагеновой матрицей. (2 часа)
- Положите на лед 10x PBS, воду, 1 N NaOH и коллаген из крысиного хвоста. Приготовьте рабочий раствор коллагена в соответствии с инструкцией производителя. Выдерживайте на льду до тех пор, пока не будут готовы конструкции, засеянные клетками (до 1 часа).
- Извлеките из инкубатора шелковые конструкции, засеянные клетками, и аспирируйте лишнюю среду.
- Перенесите каркасы в пустые лунки на луночной пластине с помощью стерильных щипцов и погрузите каждый каркас в 100 μл раствора коллагена 3 мг/мл. Поместите планшет для культивирования тканей обратно в инкубатор на 30 минут, чтобы обеспечить полимеризацию коллагена.
- Внесите 100 мкл предварительно подогретой среды для клеточных культур. Культивируйте конструкции в течение одной недели, меняя среду каждый день, заменяя только половину объема среды.
