$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Период дифференцировки перед заменой покрытия
- Дифференцируйте нейроны на 10-сантиметровых тарелках, используя протокол выбора, до тех пор, пока нейроны не сформируют густую сеть со своими отростками и не будут экспрессировать не только ранние нейронные маркеры, такие как MAP2 или TuJ1, но и поздние маркеры, такие как NeuN.
- Меняйте половину выбранной среды каждые 4 дня в процессе дифференцировки нейронов.
заметка: Более обширные или частые изменения среды разбавляют основные трофические факторы и могут препятствовать созреванию.
- Для нейронов WT126, полученных из iPSC, используйте следующие среды для культивирования после дифференцировки: 5 мл 100x N2 (нейронной) добавки, 10 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF), 10 нг/мл нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF), 1 мкг/мл ламинина, 200 мкМ аскорбиновой кислоты, 1 мкМ дибутирил-цАМФ и 10 мл SM1 для 500 мл модифицированной Дульбекко смеси Игл-среда и питательные вещества F-12 (DMEM/F12). Постепенно, используя полумедиа-изменения, заменяйте на нейронную базальную среду (Table of Materials) и такие же добавки.
- Для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или нейронов CVB WT, полученных из iPSC, используйте следующую среду для постдифференцировочного культивирования: 500 мл нейронной базальной среды А (Таблица материалов) и 500 мл среды DMEM/F12 с 2 мкг/мл ламинина, 10 мл добавки глутамина (Таблица материалов), 0,75 мг/мл бикарбоната натрия, 5 мл минимально незаменимой среды (MEM) заменимых аминокислот, 0,2 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нг/мл BDNF, 20 мл 50x B27 и 10 мл 100x N2.
2. Покрытие мультилунок
- За день до повторного покрытия покрыть поли-L-орнитином (PLO). Растворите PLO в стерильной воде до получения исходного раствора (10 мг/мл). Храните этот запас при температуре -20 °C. Разведите PLO 1:100 в воде до получения концентрации 50 мкг/мл при покрытии стекла и соотношения 1:1 000 (10 мкг/мл) при покрытии пластика.
- Нанесите покрытие непосредственно на целевые пластины. Используйте объем покрытия, соответствующий размеру планшета (т.е. для 24-луночного планшета нанесите 500 μл раствора PLO на лунку).
- Оставьте тарелки на ночь в темноте при комнатной температуре.
- Извлеките пластины с покрытием в день повторного покрытия и переложите в стерильный шкаф биобезопасности.
- Отсадите раствор PLO и дважды промойте стерильной водой.
- Разведите ламинин (1,15 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере (PBS) в разведении 1:400.
заметка: Разморозьте ламинин при 4 °C и быстро добавьте в PBS, чтобы избежать скопления ламинина и неравномерного покрытия.
- Отсадите стерильную воду и нанесите 500 μл ламининового покрытия на лунки, предварительно покрытые PLO.
- Поместите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C минимум на 4-6 ч. Используйте более длительные инкубации, до 16 часов, для стеклянных поверхностей. Используйте постоянное время инкубации.
3. Реллирование дифференцированных нейронов
- Один раз аккуратно промойте пластину дифференцированных нейронов с помощью PBS. Диспергируйте PBS аккуратно вниз по стенке пластины, а не непосредственно на ячейки, чтобы не нарушить их.
- Осторожно отсасывайте PBS, стараясь не касаться клеток напрямую, но отсасывайте от края чашки, наклоняя ее к исследователю.
- Внесите минимум 1 мл протеолитического фермента (Таблица материалов) на 10-сантиметровую пластину и верните клетки в инкубатор. Добавьте немного больше объемов, если помещение для культивирования тканей демонстрирует высокую скорость испарения из-за низкой влажности.
- Инкубируйте клетки с протеолитическим ферментом в течение 40-45 минут, чтобы отделить их от пластины и отделить от других нейронов внутри нейронной сети.
заметка: Время на этом этапе имеет решающее значение. Слишком раннее гашение протеазы может привести к усилению гибели клеток после повторного погашения. Производитель протеолитических ферментов рекомендует использовать температуры значительно ниже 37 °C с более длительными периодами инкубации для прохождения клеточных линий (например, в течение ночи при 4 °C). Тем не менее, следует избегать работы с нейронами при температуре 4 °C, так как они часто показывают плохую выживаемость после воздействия холода. Производитель также заявляет, что 60-минутная инкубация с ферментом при 37 °C приводит к его ферментативной инактивации. Однако, по опыту авторов, 40-45-минутная инкубация культур нейронов, полученных из hiPSC, при температуре 37 °C достаточна для эффективной диссоциации и отличной выживаемости нейронов после повторного подключения.
- Проверяйте нейроны на фазово-контрастном микроскопе во время инкубации и продолжайте лечение протеазой до тех пор, пока нейронная сеть полностью не отделится от пластины и не начнет распадаться на более мелкие листы при кратковременном встряхивании пластины под микроскопом.
- Погасите активность протеазы, используя 5 мл свежей среды DMEM на 1 мл протеазы в 10-сантиметровой пластине, чтобы остановить пищеварение. Аккуратно растирайте клетки относительно планшета 5-8 раз, чтобы нарушить сеть, используя серологические пипетки. Будьте осторожны и не оказывайте слишком большого давления при тритуировании, так как дифференцированные нейроны хрупкие. Не используйте наконечник P1000, так как его конец слишком острый и узкий, что может привести к отвесу или повреждению нейронов.
- Раствор с клетками нанесите через клеточное ситечко с ячейкой диаметром 100 мкм в свежую коническую пробирку объемом 50 мл по каплям.
- Промойте ситечко еще 5 мл свежей среды DMEM после того, как клетки пройдут через нее.
- Вращайте ячейки в настольной центрифуге при давлении 1 000 x g в течение 5 минут.
- Верните коническую трубку в шкаф биобезопасности и отсадите большую часть среды, оставив около 250 мкл для удержания влаги клетками.
- Мягко ресуспендируйте клетки в 2 мл свежей среды DMEM. Не прижимайте гранулу пипеткой к боковой стороне пробирки. Вместо этого аккуратно переверните коническую трубку 2-3 раза и пропустите клетки через конец серологической пипетки объемом 5 мл, чтобы выбить их.
- Нанесите 10 мкл ресуспендированных нейронов на край гемоцитометра.
- Добавьте 8-10 мкл трипанового синего в каплю клеток, чтобы оценить жизнеспособность клеток на этом этапе ресуспендирования. Нанесите 10 мкл этой смеси на гемоцитометр или другие автоматические счетчики клеток. Оцените как жизнеспособные те клетки, которые имеют фазовую яркость и исключите трипановый синий краситель.
- Определите количество жизнеспособных клеток/мл и приготовьтесь разбавить содержимое конической трубки в соответствии с желаемой плотностью клеток.
- Планшет ~10 000 клеток на лунку для 384-луночного планшета; планшет ~150 000-200 000 элементов на лунку для 24-луночного планшета.
- Добавьте свежий DMEM в коническую трубку ресуспендированных клеток для достижения соответствующего разведения и добавьте дополнительные соответствующие добавки, такие как B27 и/или BDNF, в зависимости от требований конкретной клеточной линии.
- Аккуратно наклоните коническую трубку, чтобы перемешать 2-3 раза.
- Нанесите покрытие из аспирата ламинина с 24-луночного планшета или с 384-луночного многолуночного планшета с помощью 16-канальной пипетки и промойте один раз PBS.
- Аспирация PBS с помощью P1000 для 24-луночного планшета или 16-канальной пипетки для 384-луночных планшетов.
- Нанесите раствор ячейки в каждую лунку движением в виде восьмерки, чтобы избежать комков. Однородность покрытия также может быть оптимизирована за счет использования автоматизированных устройств для работы с жидкостями.
заметка: Добавление ламинина в среду через 2-4 дня после повторного нанесения также помогает поддерживать однородное распределение клеток.
- Повторите шаги 3.19 и 3.20 для каждой лунки.
- Верните тарелку в инкубатор, установленную на 37 °C и 5% углекислого газа.
- Через 2 дня начните менять половину среды каждые 4 дня, используя среду для культивирования после дифференцировки, описанную в разделе 1.2.