$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Изготовление пресс-формы СУ-8 методом фотолитографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура связана с опасными химическими веществами. Используйте вытяжной шкаф и СИЗ во всем помещении.
- Очистите кремниевую пластину (диаметром 4 дюйма, толщиной 1 мм, полированной) ацетоном и обдувите газообразным азотом. Затем выпекать при 180 °C в течение 3 минут, чтобы высохнуть.
- Выдавите 3 мл SU-8 2100 на очищенную пластину.
- Равномерно нанесите SU-8 на пластину с помощью прядильного аппарата при 500 об/мин в течение 10 с, а затем последовательно отжмите со скоростью 1500 об/мин в течение 30 с с ускорением 300 об/мин для получения слоя SU-8,<бр/> толщиной 150 мкм
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что силиконовая пластина расположена в центре вращающейся машины для нанесения покрытий и правильно зафиксирована вакуумом.
- Мягкая вафля выпекается на конфорке при температуре 50 °C в течение 10 минут, при температуре 65 °C в течение 7 минут и при температуре 95 °C в течение 45 минут.
- Установите фотошаблон (рис. 1) на выравниватель маски и экспонируйте ультрафиолетовый свет (365 нм) в течение 60 с.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции должно быть оптимизировано за счет соответствующей дозы ультрафиолетового излучения.
- После выдержки выпекать при температуре 65 °C в течение 6 минут и при 95 °C в течение 13 минут на горячей плите.
- Проявите пластину в течение 10-20 мин в проявителе SU-8 с перемешиванием с помощью орбитального вибростенда, меняя проявочный раствор один раз за процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте время проявки, когда останутся обломки СУ-8.
- Промойте в изопропаноле и аккуратно высушите пластину газообразным азотом.
- Измерьте высоту осажденного SU-8 с помощью измерительного микроскопа и убедитесь, что его толщина составляет около 150 мкм. Его можно хранить неограниченное время при комнатной температуре.
2. Производство микрофлюидных чипов для тканевых культур на основе полидиметилсилоксана (PDMS)
- Закрепите отсаженную пластину SU-8 на контейнере (например, в пластиковой чашке Петри 15 см) с помощью двустороннего скотча.
- Сдуйте пыль с пластины с помощью газообразного азота.
- Для силанизации поместите отсаженную пластину SU-8 в вакуумную камеру вместе с небольшим контейнером (например, чашкой 35 мм). Капните 10 мкл (тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил)-1-трихлорсилана в маленькую емкость. Не наносите (тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил)-1-трихлорсилан непосредственно на пластину SU-8.
- Плотно закройте вакуумную камеру и включите вакуумный насос не менее чем на 2 часа.
- Возьмите пластиковый стаканчик и залейте силиконовый эластомер (например, Silpot 184 или эквивалент, Sylgard 184) и отвердитель в соотношении 10:1 по весу. Затем хорошо перемешайте с помощью шпателя и дегазируйте в вакуумной камере до полного удаления пузырьков.
- Залейте смесь PDMS в емкость с пластиной SU-8 до нужной толщины (3-4 мм) и снова дегазируйте для удаления пузырьков.
- Выпекайте PDMS в духовке при температуре 60 °C не менее 3 часов для полного отверждения PDMS.
- После охлаждения отвержденные PDMS отрежьте от пластины с помощью скальпеля или бритвенного лезвия.
- Чтобы создать две камеры чипа для культуры ткани, проделайте два отверстия в местах расположения двух отсеков с помощью биопсийного перфоратора диаметром 1,5 мм.
- Чтобы создать средний резервуар, приготовьте еще одну смесь PDMS (силиконовый эластомер и отвердитель в весовом соотношении 10:1) и вылейте ее в новую чашку Петри диаметром 10 см. Отрегулируйте объем заливки до 5 мм толщины PDMS.
- Выпекайте PDMS в духовке при температуре 60 °C не менее 3 часов для полного отверждения PDMS.
- После охлаждения ПДМС скальпелем срежьте отвержденный ПДМС, чтобы получить прямоугольное кольцо.
- Склейте нижний слой со средним резервуаром, нанеся между ними неотвержденный PDMS и запекая собранные слои PDMS. Эта связанная структура приводит к получению чипа для культуры тканей PDMS.
- Очистите чип культуры тканей PDMS скотчем, чтобы удалить пыль и мелкие частицы с поверхности. Чипы для культивирования тканей PDMS можно хранить при комнатной температуре, если они защищены от пыли и ультрафиолета.
3. Подготовка культуры
- Питательная среда
заметка: Все перечисленные ниже среды должны быть отфильтрованы для стерилизации, если не указано иное. Подготовленные среды можно хранить при температуре 4 °C и использовать в течение месяца.
- Для приготовления среды mTeSR Plus: смешайте одну бутылку 100 мл добавки mTeSR Plus 5x с одной бутылкой 400 мл базальной среды mTeSR Plus.
- Для приготовления 100 мл среды KSR: В 85 мл модифицированной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium или DMEM/F12 добавьте 15 мл заменителя сыворотки Knockout (KSR, 15%), 1 мл коммерческой добавки глутамина (1%) и 1 мл заменимой аминокислоты (NEAA, 1%).
- Для приготовления 100 мл среды N2: В 100 мл нейробазальной среды добавьте 1 мл N2 (100x), 1 мл коммерческой добавки глютамина и 1 мл NEAA.
- Для приготовления 250 мл среды созревания: В 250 мл нейробазальной среды добавьте 5 мл B27 (2%), 2,5 мл коммерческой добавки глутамина (1%) и 2,5 мл пенициллина/стрептомицина (1%).
- Ресуспендируйте соединения (ретиноевая кислота (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) в ДМСО клеточной культуры до желаемой концентрации. Подготовьте аликвоты и храните их при температуре -20 °C до 6 месяцев. Используются следующие стоковые растворы: 1 мМ RA, 10 мМ SB431542, 100 мкМ LDN-193189, 10 мМ SU5402, 10 мМ DAPT, 1 мМ SAG, 10 мМ Y-27632.
- Покрытие
заметка: Чтобы предотвратить полимеризацию матрицы базальной мембраны под воздействием тепла, избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания. По возможности выполняйте все процедуры нанесения покрытия с помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток и пробирок. Матрикс базальной мембраны следует разморозить в течение ночи при 4 °C и аликировать с помощью предварительно охлажденных наконечников и трубок для пипеток. Аликвоты можно замораживать при температуре -20 °C или -80 °C.
- Разморозьте замороженную аликвоту при 4°C на льду. Аликвоту следует хранить в холоде во время процедуры нанесения покрытия. С помощью предварительно охлажденного наконечника для дозатора разбавьте матрицу базальной мембраны ледяным веществом DMEM/F12 в соотношении 1:40. Неиспользованная разбавленная матрица базальной мембраны может храниться при температуре 4 °С в течение 2-3 суток, при условии, что полимеризация не произошла.
- Добавьте 1 мл матрицы базальной мембраны/раствора DMEM-F12, чтобы покрыть одну лунку 6-луночного планшета.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре не менее часа, или 4 °C в течение ночи. Пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 °C не более одной недели.
4. Обслуживание iPS-ячеек
- Приготовьте посуду с матричным покрытием из базальной мембраны, как упоминалось ранее в шаге 3.2.
- Полностью аспирируйте среду mTeSR Plus. Промойте лунку один раз PBS и добавьте 0,5 мл реагента для пропускания (см. Таблицу материалов). Подождите несколько секунд и аспирируйте раствор.
- Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в инкубаторе в течение 5 минут или до тех пор, пока ячейки не станут круглыми.
заметка: Время инкубации может варьироваться в зависимости от различных клеточных линий iPS и места слияния. Периодически проверяйте под микроскопом, чтобы определить время диссоциации во время инкубации.
- Добавьте 1 мл среды mTeSR Plus и постучите по пластине в течение 30-60 с, чтобы отделить колонии.
- Аккуратно смешайте 1 мл раствора клеточной суспензии с 7 мл свежего mTeSR плюс среда. Не пипетируйте более 5 раз.
- Тарелка в соотношении 1:8. Как правило, добавляют 1 мл суспензии, начиная с шага 5.5, и добавляют 1 мл mTeSR плюс среду с добавлением 5-10 мкМ Y-27632 (ингибитор ROCK). Коэффициент разведения пассажа зависит от линии iPSC.
- Поместите клетку в инкубатор с температурой 5% CO2/37 °C. На следующий день удалите Y-27632, добавив свежий средний слой mTeSR Plus. После этого сначала меняйте среду через день и каждый день по мере того, как клетка достигает более высокой конфлюенции.
5. Дифференцировка iPS-клеток в моторные нейроны
- Пассирование иПСК для дифференцировки моторных нейронов
заметка: Дифференцировка может быть успешно проведена в 3D (5.2) протоколе.
- Позвольте недифференцированным iPS-клеткам расти до тех пор, пока они не достигнут конфлюенции примерно 80% в среде mTeSR Plus в 6-луночном планшете.
- Полностью отсасывайте среду. Сразу же промойте лунку стерильным PBS и добавьте в клетки 0,5 мл раствора для диссоциации клеток.
- Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в инкубаторе в течение примерно 2-3 минут или до тех пор, пока ячейки не станут разделенными и круглыми, но останутся прикрепленными к лунке.
- Добавьте 1 мл среды и осторожно несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл, состоящую из 4 мл среды.
- Центрифугируйте при 200 х г в течение 3 мин.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, не беспокоя гранулу, и повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и перейдите к 5,2 (3D-дифференцировка).
- Формирование сфероида моторных нейронов (MNS) в 3D дифференцировке ("3D протокол")
заметка: Полное изменение среды производится ежедневно с 0 по 12 день дифференцировки (Рисунок 2).
- Засейте iPS-клетки с шага 5.1.7 в 96-луночный U-нижний планшет с концентрацией 40 000 клеток/лунку в 100 мкл mTeSR Plus с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- На следующий день замените каждую лунку на 100 мкл свежей среды.
- В дни 0 и 1: Аспирируйте питательную среду и замените 100 мкл среды KSR (3.1.2) с добавлением 10 мкМ SB431542 и 100 нМ LDN-193189.
- На 2 и 3 дни: Отсадите питательную среду и замените ее 100 мкл среды KSR с добавлением 10 мкМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 5 мкМ DAPT, 5 мкМ SU5402, 1 мкМ RA и 1 мкМ SAG.
- На 4 и 5 дни: Приготовьте смешанную среду, состоящую на 75% из среды KSR и на 25% из среды N2 (3.1.3). Затем отсасывайте питательную среду и заменяйте ее 100 мкл смешанной среды с добавлением 10 мкМ SB431542, 100 нМ LDN-193189, 5 мкМ DAPT, 5 мкМ SU5402, 1 мкМ RA и 1 мкМ SAG.
- На 6 и 7 дни: Приготовьте смешанную среду, состоящую на 50% из среды KSR и на 50% из среды N2. Затем аспирируют питательную среду и заменяют ее 100 мкл смешанной среды с добавлением 5 мкМ DAPT, 5 мкМ SU5402, 1 мкМ ретиноевой кислоты и 1 мкМ SAG.
- На 8-й и 9-й дни: Приготовьте смешанную среду, состоящую на 25% из среды KSR и на 75% из среды N2. Затем аспирируют питательную среду и заменят 100 мкл смешанной среды с добавлением 5 мкМ DAPT, 5 мкМ SU5402, 1 мкМ RA и 1 мкМ SAG.
- На 10 и 11 дни: Замените среду на 100 мкл N2 с добавлением 5 мкМ DAPT, 5 мкМ SU5402, 1 мкМ RA и 1 мкМ SAG.
- На 12-й день: Приступайте к переносу МН в чип для культуры тканей (Шаг 6) или замените среду 100 мкл среды для созревания (3.1.4) с добавлением 20 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF).
заметка: MNS может быть перенесен на чип для культуры тканей с 12-го по 19-й день. Сфероиды, которые не были перенесены, должны быть культивированы в 96 луночных U-нижних планшетах в среде для созревания с добавлением 20 нг/мл BDNF до переноса.
6. Подготовка чипа для культивирования тканей для формирования органоида двигательного нерва (MNO)
- Стерилизуйте подготовленный PDMS (начиная с шага 2.13) путем погружения его в 70% этанол в чашке Петри не менее чем на 1 ч.<бр/>
заметка: Все последующие шаги следует выполнять в шкафу биобезопасности.
- Простерилизуйте стекло микроскопа (76 x 52 мм), погрузив его в 70% этанол в чашке Петри.
- В процессе сушки стекла микроскопа поместите устройство PDMS на наполовину мокрое стекло микроскопа и дайте ему полностью высохнуть, подожд в течение ночи. После полного высыхания устройство PDMS должно прилипнуть к стеклу.
заметка: Это склеивание не является постоянным, чтобы позволить отсоединить устройства PDMS от стекла микроскопа после посева для забора ткани. Постоянное связывание кислородной плазмой может быть использовано для максимизации адгезии между PDMS и стеклом, но это предотвратит разборку чипов и сбор тканей.
- Покройте поверхность микроканала в стекле PDMS и микроскопа 30 мкл разбавленной матрицы базальной мембраны в DMEM/F12 (1:40), сделав каплю с одной стороны входного отверстия канала, а затем отасуньте раствор с другой стороны входного отверстия с помощью пипетки или аспиратора (рис. 3A). Не отсасывайте слишком большой объем раствора, чтобы избежать загрязнения пузырьками.
- Затем инкубируйте устройство PDMS в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C во вторичном контейнере (например, в чашке Петри).
7. Образование моторных нервных органоидов (MNO)
- Перед применением замените раствор покрытия предварительно подогретым 150 мкл среды для созревания с добавлением 20 нг/мл BDNF.
- Затем поместите MNS из шага 5.2.9 во входное отверстие микроканала с помощью микропипетки с широким наконечником. MNS может самопроизвольно оседать на дне устройства под действием силы тяжести. Не прилагайте слишком большое давление при введении MNS (Рисунок 3B).
заметка: Если MNS застрял на боковой стенке отверстия в чипе для культуры тканей, осторожно отсасывайте раствор с другой стороны входного отверстия.
- Наполните небольшой резервуар (например, крышку из пробирки объемом 15 мл) стерильной водой и поместите его рядом с чипом для культуры тканей во вторичном контейнере, чтобы предотвратить испарение среды. Затем поместите его в инкубатор с температурой 5% CO2/37 °C.
- Для изменения среды отсасывайте отработанную питательную среду из центра резервуара среды (Рисунок 3C). Не отсасывайте всю среду и ткани.
- Аккуратно добавьте свежую среду для созревания (с BDNF). Среду следует менять каждые 2-3 дня. Не сушите питательную среду в любое время во время культивирования. Аксоны вырастают из MNS в канал и спонтанно собираются в единый пучок за 2-3 недели, что приводит к образованию MNO. MNO может культивироваться более чем на 1 месяц в устройстве.
