Стимуляция дифференцировки нервных стволовых клеток с помощью лечения холодной атмосферной плазмой

Аннотация

Источник: Xiong, Z., et al. Дифференцировка нервных стволовых клеток с помощью одноэтапной обработки холодной атмосферной плазмой in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео представлен метод запуска дифференцировки в нейральных стволовых клетках с использованием холодной атмосферной плазмы. При этом генерируется ультрафиолетовое излучение и реактивные молекулы, стимулирующие нервные клетки производить проекции, указывающие на дифференцировку нейронных клеток.

Протокол

1. Клеточные культуры и предифференцировка

1. Культивирование нейральных стволовых клеток и предифференцировка
   1. Подготовьте покровные листы, покрытые поли-D-лизином. Поместите стерильный покровный стакан (диаметром 20 мм) в 12-луночный планшет. Покройте покровное стекло поли-D-лизином, 0,1% по массе, в воде для лучшей адгезии клеток на покровных стеклах, выполнив следующие действия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные условия должны быть определены для каждой клеточной линии и области применения.
      1. Асептически покройте поверхность покровного стекла поли-D-лизином, 0,1% по массе, в воде. Осторожно покачивайте, чтобы обеспечить равномерное покрытие поверхности покровного стекла.
      2. После культивирования в течение ночи (~12 часов) при 37°C удалите раствор поли-D-лизина и промойте поверхность 3 раза 1 мл стерильной воды.
      3. Просушите ячейки не менее чем за 30 минут до их посева.
2. Культивирование мышиных нейральных стволовых клеток C17.2 (C17.2-NSC) и предифференцировка
   1. Инкубируйте C17.2-NSC в колбе 25 см 2 в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 5% лошадиной сыворотки (HS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5% CO2 в течение ~2 - 3d.
   2. Когда клетки достигнут 85% конфлюенции, удалите среду, промойте клетки 1 мл PBS и добавьте в колбу 1 мл свежего трипсина (0,25%). Оставьте на 1 минуту; затем добавьте 1 мл питательной среды в колбу и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы получить одноклеточную суспензию.
   3. Посчитайте плотность клеток в суспензии с помощью гемоцитометра. Рассчитайте требуемый объем клеточной суспензии, чтобы получить конечную концентрацию клеток 2 x 10⁴ клеток/мл.
   4. Засейте C17.2-NSC на покровные стекла с покрытием в 12-луночный планшет с плотностью ~2 x 10 4 ячейки на лунку. Проверьте плотность клеток под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучшего результата перед экспериментом по иммунофлуоресценции необходимо определить оптимальную плотность клеток.
   5. Инкубируйте клетки при температуре 37°C в клеточном инкубаторе в течение 12 часов, чтобы обеспечить присоединение.
   6. После присоединения клетки 2 раза промыть 1 мл PBS и культивировать клетки дифференцировочной средой, состоящей из DMEM/F12 с 1% добавкой N2, в течение 48 ч перед обработкой плазмой.
3. Культура первичных нейральных стволовых клеток крыс и предифференцировка
   1. Культивирование первичной суспензии NSC (нейральных стволовых клеток) крысы в питательной среде NSC крысы в непокрытых колбах T25 с плотностью 5 x 10⁵ клеток.
   2. Проверьте образование нейросфер под перевернутым микроскопом. Убедитесь, что морфология нейросфер демонстрирует сферические и прозрачные многоклеточные комплексы.
   3. Когда нейросферы достигнут диаметра 3 мм или более, перенесите суспензию нейросферы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и дайте нейросферам осесть под действием силы тяжести.
   4. Осторожно удалите надосадочную жидкость, чтобы оставить нейросферы в минимальном объеме среды.
   5. Промойте нейросферы 1 раз 5 мл PBS и дайте нейросферам осесть под действием силы тяжести. Удалите надосадочную жидкость, чтобы оставить минимальный объем PBS.
   6. Добавьте подходящий объем среды для дифференцировки, чтобы довести плотность клеток до ~12 - 15 нейросфер на миллилитр. Среда для дифференцировки первичных НСК крыс состоит из DMEM/F12, 2% B27 и 1% FBS.
   7. Засейте 1 мл суспензии нейросферы на каждый покрытый покровный лист в 12-луночном планшете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхните пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение нейросфер. Этот шаг имеет решающее значение для лучшего результата иммунофлюоресценции.
   8. Поместите планшет в инкубатор и дайте ему предварительно дифференцироваться в течение 24 часов перед плазменной обработкой.

2. Подготовка плазменных струй

1. Выберите полуоткрытую кварцевую трубку с внутренним диаметром 2 мм и внешним диаметром 4 мм. Вставьте в трубку высоковольтный провод диаметром 2 мм.
2. Вставьте кварцевую трубку с высоковольтным проводом в шприц объемом 5 мл и с помощью держателя закрепите ее внутри центра шприца. Установите расстояние между герметичным концом кварцевой трубки и наконечником шприца на уровне 1 см.
3. Подсоедините трубку из силиконовой резины длиной 1 м (с внутренним диаметром 12 мм) к открытому концу шприца, а затем последовательно подключите ее к расходомеру и газовому клапану.

3. Приобретение "Джетс"

1. Подключите цепь, как показано на рисунке 1. Подключите выходной провод источника питания к плазменно-струйному устройству, а затем соедините наконечник высоковольтного зонда с выходным проводом для определения напряжения. Подключите другой конец высоковольтного щупа к осциллографу, чтобы записать информацию о выходном напряжении. Проверьте всю цепь и убедитесь, что источник питания, осциллограф и высоковольтный пробник заземлены.
2. Проверьте газовую магистраль. Убедитесь, что газовая трубка подключена к плазменно-струйному устройству; затем откройте газовый клапан гелия (объемная доля 99,999%) и кислорода (объемная доля 99,999%) и установите расход газа на 1 л : 0,01 л/мин (He:O₂).<бр /> ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте газу течь в течение нескольких минут перед первым включением источника питания.
3. Установите амплитуду, частоту и ширину импульса на 8 кВ, 8 кГц и 1600 нс соответственно. Проверьте схему еще раз, а затем включите кнопку вывода для создания плазменной струи.
   ВНИМАНИЕ: Ни в коем случае не прикасайтесь к высоковольтному проводу.

4. Плазменная терапия нейральных стволовых клеток

1. Установите расстояние между соплом шприца и отверстием ячейки 15 мм.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние измеряется от нижней части платформы, на которой размещена 12-луночная пластина.
2. Извлеките из инкубатора 12-луночный планшет и замените среду для предварительно дифференцированных клеток на 800 мкл свежей дифференцировочной среды.
3. Разделите клетки на три группы: контрольную группу без лечения, группу обработки потоком газа He-and-O-2 (1%) с и группу плазменной обработки 60 с><. ПРИМЕЧАНИЕ: В условиях лечения нет явной потери жидкости.
4. Поместите 12-луночный планшет под плазменные струи, убедитесь, что сопло шприца закреплено в центре каждого отверстия, и проведите соответствующую обработку различных групп, упомянутых в шаге 4.3.
   Примечание: Необработанные контрольные группы содержались в дифференцировочной среде при комнатной температуре во время экспериментальной процедуры для обеспечения однородных условий обработки. В группе обработки потоком газа He-and-O2 (1%) проводилась обработка только потоком газа He и_O2 (1%) без генерации плазмы. Все процедуры должны проводиться в трех экземплярах.

5. Дифференцировка нейральных стволовых клеток

1. После обработки удалите исходную культуру и добавьте по 1 мл новой среды для дифференцировки в каждую лунку.
2. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37°C и 5% CO2 в течение 6 дней. Меняйте среду через день.
3. Ежедневно проверяйте состояние дифференцировки различных групп под микроскопом с инвертированным фазово-контрастным светом Рисунок 2. Случайным образом выберите не менее 12 полей и сделайте фотографии, чтобы зафиксировать морфологические изменения.

Результаты

Рисунок 1: Схема экспериментальной установки. Плазменно-струйный аппарат подключается к выходному проводу высоковольтного источника питания. Высоковольтный щуп с осциллографом используется для определения выходного напряжения. Когда рабочие газы проходят через шприц и включается высокое напряжение, плазменная струя генерируется и распространяется в открытый воздух.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Coverslip	ГНЕЗДО	801008
Поли-D-лизин	Бейотим	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	хранится при 4 °C
DMEM/F12 средний	HyClone	SH30023.01B	хранится при 4 °C
N2 дополнение	Gibco	17502048	хранить при -20 °C и беречь от света
Дополнение к B27	Gibco	17504044	хранить при -20 °C и беречь от света
Фетальная бычья сыворотка	HyClone	SH30084.03	хранить при -20 °C, избегать повторного замораживания и размораживания
Донорская сыворотка для лошадей	HyClone	SH30074.03	при -20 °C, избегайте повторного замораживания и оттаивания
Пенициллин/стрептомицин	HyClone	SV30010	хранится при 4 °C
Трипсин	HyClone	25300054	при 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	при 4 °C
4% параформальдегид	Бейотим	P0098	при -20 °C
ТритонХ-100	Сигма	Т8787
Световой микроскоп	Нанкинская оптическая компания Цзяннань	XD-202
Высоковольтный усилитель мощности	Направленная энергия	ПВХ-4110
Источник питания постоянного тока	Спеллман	СЛ1200
Генератор функций	Алигент	33521A
Осциллограф	Tektronix	DPO3034
Высоковольтный щуп	Tektronix	P6015A
12-луночный планшет	corning	3512
Фляга 25 см2	corning	430639
Газообразный гелий
Газообразный кислород
Плазменный струйный ноззель
CO2-инкубатор
Силиконовая трубка			внутренний диаметр 12 мм
Мышиные нейральные стволовые клетки C17.2 (C17.2-NSC)