$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Клеточные культуры и предифференцировка
- Культивирование нейральных стволовых клеток и предифференцировка
- Подготовьте покровные листы, покрытые поли-D-лизином. Поместите стерильный покровный стакан (диаметром 20 мм) в 12-луночный планшет. Покройте покровное стекло поли-D-лизином, 0,1% по массе, в воде для лучшей адгезии клеток на покровных стеклах, выполнив следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные условия должны быть определены для каждой клеточной линии и области применения.
- Асептически покройте поверхность покровного стекла поли-D-лизином, 0,1% по массе, в воде. Осторожно покачивайте, чтобы обеспечить равномерное покрытие поверхности покровного стекла.
- После культивирования в течение ночи (~12 часов) при 37°C удалите раствор поли-D-лизина и промойте поверхность 3 раза 1 мл стерильной воды.
- Просушите ячейки не менее чем за 30 минут до их посева.
- Культивирование мышиных нейральных стволовых клеток C17.2 (C17.2-NSC) и предифференцировка
- Инкубируйте C17.2-NSC в колбе 25 см 2 в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 5% лошадиной сыворотки (HS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5% CO2 в течение ~2 - 3d.
- Когда клетки достигнут 85% конфлюенции, удалите среду, промойте клетки 1 мл PBS и добавьте в колбу 1 мл свежего трипсина (0,25%). Оставьте на 1 минуту; затем добавьте 1 мл питательной среды в колбу и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы получить одноклеточную суспензию.
- Посчитайте плотность клеток в суспензии с помощью гемоцитометра. Рассчитайте требуемый объем клеточной суспензии, чтобы получить конечную концентрацию клеток 2 x 104 клеток/мл.
- Засейте C17.2-NSC на покровные стекла с покрытием в 12-луночный планшет с плотностью ~2 x 10 4 ячейки на лунку. Проверьте плотность клеток под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучшего результата перед экспериментом по иммунофлуоресценции необходимо определить оптимальную плотность клеток.
- Инкубируйте клетки при температуре 37°C в клеточном инкубаторе в течение 12 часов, чтобы обеспечить присоединение.
- После присоединения клетки 2 раза промыть 1 мл PBS и культивировать клетки дифференцировочной средой, состоящей из DMEM/F12 с 1% добавкой N2, в течение 48 ч перед обработкой плазмой.
- Культура первичных нейральных стволовых клеток крыс и предифференцировка
- Культивирование первичной суспензии NSC (нейральных стволовых клеток) крысы в питательной среде NSC крысы в непокрытых колбах T25 с плотностью 5 x 105 клеток.
- Проверьте образование нейросфер под перевернутым микроскопом. Убедитесь, что морфология нейросфер демонстрирует сферические и прозрачные многоклеточные комплексы.
- Когда нейросферы достигнут диаметра 3 мм или более, перенесите суспензию нейросферы в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл и дайте нейросферам осесть под действием силы тяжести.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость, чтобы оставить нейросферы в минимальном объеме среды.
- Промойте нейросферы 1 раз 5 мл PBS и дайте нейросферам осесть под действием силы тяжести. Удалите надосадочную жидкость, чтобы оставить минимальный объем PBS.
- Добавьте подходящий объем среды для дифференцировки, чтобы довести плотность клеток до ~12 - 15 нейросфер на миллилитр. Среда для дифференцировки первичных НСК крыс состоит из DMEM/F12, 2% B27 и 1% FBS.
- Засейте 1 мл суспензии нейросферы на каждый покрытый покровный лист в 12-луночном планшете.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхните пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение нейросфер. Этот шаг имеет решающее значение для лучшего результата иммунофлюоресценции.
- Поместите планшет в инкубатор и дайте ему предварительно дифференцироваться в течение 24 часов перед плазменной обработкой.
2. Подготовка плазменных струй
- Выберите полуоткрытую кварцевую трубку с внутренним диаметром 2 мм и внешним диаметром 4 мм. Вставьте в трубку высоковольтный провод диаметром 2 мм.
- Вставьте кварцевую трубку с высоковольтным проводом в шприц объемом 5 мл и с помощью держателя закрепите ее внутри центра шприца. Установите расстояние между герметичным концом кварцевой трубки и наконечником шприца на уровне 1 см.
- Подсоедините трубку из силиконовой резины длиной 1 м (с внутренним диаметром 12 мм) к открытому концу шприца, а затем последовательно подключите ее к расходомеру и газовому клапану.
3. Приобретение "Джетс"
- Подключите цепь, как показано на рисунке 1. Подключите выходной провод источника питания к плазменно-струйному устройству, а затем соедините наконечник высоковольтного зонда с выходным проводом для определения напряжения. Подключите другой конец высоковольтного щупа к осциллографу, чтобы записать информацию о выходном напряжении. Проверьте всю цепь и убедитесь, что источник питания, осциллограф и высоковольтный пробник заземлены.
- Проверьте газовую магистраль. Убедитесь, что газовая трубка подключена к плазменно-струйному устройству; затем откройте газовый клапан гелия (объемная доля 99,999%) и кислорода (объемная доля 99,999%) и установите расход газа на 1 л : 0,01 л/мин (He:O2).<бр />
ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте газу течь в течение нескольких минут перед первым включением источника питания.
- Установите амплитуду, частоту и ширину импульса на 8 кВ, 8 кГц и 1600 нс соответственно. Проверьте схему еще раз, а затем включите кнопку вывода для создания плазменной струи.
ВНИМАНИЕ: Ни в коем случае не прикасайтесь к высоковольтному проводу.
4. Плазменная терапия нейральных стволовых клеток
- Установите расстояние между соплом шприца и отверстием ячейки 15 мм.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние измеряется от нижней части платформы, на которой размещена 12-луночная пластина.
- Извлеките из инкубатора 12-луночный планшет и замените среду для предварительно дифференцированных клеток на 800 мкл свежей дифференцировочной среды.
- Разделите клетки на три группы: контрольную группу без лечения, группу обработки потоком газа He-and-O-2 (1%) с и группу плазменной обработки 60 с><.
ПРИМЕЧАНИЕ: В условиях лечения нет явной потери жидкости.
- Поместите 12-луночный планшет под плазменные струи, убедитесь, что сопло шприца закреплено в центре каждого отверстия, и проведите соответствующую обработку различных групп, упомянутых в шаге 4.3.
Примечание: Необработанные контрольные группы содержались в дифференцировочной среде при комнатной температуре во время экспериментальной процедуры для обеспечения однородных условий обработки. В группе обработки потоком газа He-and-O2 (1%) проводилась обработка только потоком газа He иO2 (1%) без генерации плазмы. Все процедуры должны проводиться в трех экземплярах.
5. Дифференцировка нейральных стволовых клеток
- После обработки удалите исходную культуру и добавьте по 1 мл новой среды для дифференцировки в каждую лунку.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37°C и 5% CO2 в течение 6 дней. Меняйте среду через день.
- Ежедневно проверяйте состояние дифференцировки различных групп под микроскопом с инвертированным фазово-контрастным светом Рисунок 2. Случайным образом выберите не менее 12 полей и сделайте фотографии, чтобы зафиксировать морфологические изменения.
