Генерация предшественников корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши

Аннотация

Источник: Tischfield, D. J., et al Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши в предшественники кортикальных интернейронов. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео представлен метод генерации предшественников корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток мыши. Протокол включает в себя культивирование стволовых клеток в средах, содержащих специфические низкомолекулярные ингибиторы, которые способствуют пролиферации стволовых клеток и их агрегации в эмбриоидные тельца (БЭ). Впоследствии БЭ диссоциируют ферментами и наносят на лунки культуральных планшетов, покрытые белками адгезии, чтобы способствовать их дифференцировке в предшественники корковых интернейронов.

Протокол

1. Подготовка среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрейте все среды до 37 ° C перед использованием в клеточной культуре.

1. Среда для эмбриональных фибробластов мыши (MEF) (для приготовления 500 мл)
   1. Добавьте 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 449 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) и профильтруйте через 500 мл фильтрующей установки 0,22 мкм.
   2. Добавьте 1 мл противомикробного средства (50 мг/мл) после фильтрации. Хранить среду при температуре 4 °C до 1 месяца или при температуре ≤ -20 °C.
2. Среда N2 (для приготовления 500 мл)
   1. Добавьте 5 мл L-аланин-L-глутамина (100x) и 500 мкл 2-меркаптоэтанола (55 мМ) в 489,5 мл DMEM: Питательная смесь F-12 (DMEM/F-12) и отфильтруйте через фильтрующую установку для пор объемом 500 мл 0,22 мкм.
   2. Добавьте 1 мл противомикробного средства (50 мг/мл) и 5 мл N2 добавки-B после фильтрации. Храните носитель при температуре 4 °C в темноте до 1 месяца.
3. Бессывороточная питательная среда (KSR) (для приготовления 500 мл)
   1. Добавьте 75 мл добавки среды, не содержащей сыворотки, 5 мл L-глутамина (100x), 5 мл заменимых аминокислот MEM (MEM-NEAA) (100x) и 500 мкл 2-меркаптоэтанола (55 мМ) до 413,5 мл DMEM, не содержащего глютамин, и отфильтруйте через 500 мл фильтра пор 0,22 мкм.
   2. Добавьте 1 мл противомикробного средства (50 мг/мл) после фильтрации. Храните носитель при температуре 4 °C до 1 месяца.
4. Среда для эмбриональных стволовых клеток мыши (для приготовления 500 мл)
   1. Добавьте 75 мл FBS для стволовых клеток, 5 мл MEM-NEAA (100x), 5 мл L-глутамина (100x) и 500 мкл 2-меркаптоэтанола (55 мM) до 413,5 мл DMEM, не содержащего глутамин, и профильтруйте через 500 мл фильтрующего устройства с порами 0,22 мкм.
   2. Добавьте 1 мл противомикробного средства (50 мг/мл) после фильтрации. Храните носитель при температуре 4 °C в темноте до 1 месяца или в течение ≤ -20 °C.

2. Культивирование mESCs

1. Пластинируйте митотически неактивные клетки-питатели MEF в средах MEF на планшеты, обработанные тканевой культурой, со скоростью 3-4 x 10⁴ клеток/^см2. Дайте им не менее 12 часов, чтобы они осядли в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C при относительной влажности ≥ 95% и 5%_CO2, прежде чем осаждать mESCs. Если вы не используете его сразу, заменяйте фильтрующий материал каждые 3 дня. Утилизируйте MEF, если они не были использованы, в течение 7 дней после нанесения.
2. Добавляйте mESCs (диапазон плотности от 1-4 x 10 до⁴ клеток/^см2) к пластинам MEF в средах mESC, содержащих фактор ингибирования лейкемии мышей (mLIF) (1000 Ед/мл). Инкубируйте клетки при температуре 37 °C при относительной влажности ≥ 95% и 5%_CO2.
3. Проведите mESCs с использованием трипсин-ЭДТА (0,05% трипсина) (1:5-1:10) после того, как блюдо становится ~ 70-80% сливающимся или если колонии начинают соприкасаться. Обычно это происходит каждые 2 дня, но может занять до 4 или 5 дней, в зависимости от исходной плотности покрытия.
4. Поддерживайте mESCs на слое фидера MEF в среде mESC для сохранения плюрипотентности.
5. Прежде чем начать дифференцировку, пропустите клетки по крайней мере один раз на пластины, покрытые желатином, без MEF, чтобы разбавить MEF.​
   1. Приготовьте покрытые желатином пластины, добавив 0,1% желатина в фосфатно-солевой буфер (PBS) с Ca²⁺/Mg²⁺ в чашку, обработанную культурой тканей, и оставьте при температуре 37 °C не менее чем на 1 ч. Планшет 1,5-2 x 10 6 клеток/10 см планшет (2,7-3,6 x 10⁴ клеток/см²) и дайте клеткам разрастись в течение 2 дней до начала дифференцировки.

3. Дифференциация mESCs в MGE-подобные теленцефальные предшественники

1. День дифференцировки (DD) 0 = "флоат-клетки"
   1. После того, как mESCs вырастут на пластинах, покрытых желатином, в течение 2 дней, аспирируйте среду и промойте клетки один раз PBS без Ca²⁺/Mg²⁺. Добавьте достаточное количество трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина), чтобы покрыть поверхность планшета (обычно 4 мл трипсина-ЭДТА на одну чашку для культуры тканей длиной 10 см), и поместите клетки обратно в инкубатор при температуре 37 °C с относительной влажностью ≥95% и 5%_СО2 на 4 минуты.
   2. Через 4 минуты угасите трипсин-ЭДТА, используя в 2 раза больший объем с помощью среды mESC. Переложите ячейки в центрифужную трубку соответствующего размера и центрифугируйте ячейки при давлении 200 x g в течение 5 минут. Через 5 минут извлеките трубку и аспирируйте среду, не повреждая гранулы. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды KSR:N2 (1:1), содержащей ингибитор BMP LDN-193189 (250 нМ) и ингибитор Wnt XAV-939 (10 мкМ).
   3. Измерьте концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Начните выращивание клеток в качестве эмбриоидных телец (БЭ), добавив 75 000 клеток/мл в среде KSR:N2 (1:1), содержащей LDN-193189 (250 нМ) и XAV-939 (10 мкМ) в неадгезивных чашках для культивирования тканей. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C при относительной влажности ≥ 95% и 5%_CO2.
2. На DD1 подготовьте к «посадке» клеток, покрыв обработанные культурой тканей чашки поли-L-лизином (10 мкг/мл в PBS с Ca²⁺/Mg²⁺) в течение ночи (О/Н) при 37 °C при относительной влажности ≥ 95% или в течение не менее 1 ч.
3. На DD2 аспирируйте поли-L-лизин и покройте пластины ламинином (10 мкг/мл в PBS с Ca²⁺/Mg²⁺) O/N при 37 °C при относительной влажности ≥ 95%.
   заметка: Хотя O/N является оптимальным, всего 2 часа может быть достаточно. Если планшеты не будут использованы на следующий день, аспирируйте ламинин, замените на PBS без Ca²⁺/Mg²⁺ и храните при температуре 4 °C до 2 недель.
4. DD3 («клетки суши»)
   1. Перед началом диссоциации БЭ аспирируйте ламинин и дайте пластинам полностью высохнуть в капюшоне для культуры тканей. Не используйте пластины, которые выглядят блестящими или заметно влажными. Переложите БЭ со средой в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 3-4 минут при 15 х г или до тех пор, пока БЭ не гранулируются.
5. Отсадите среду и добавьте 3 мл раствора для отсоединения клеток, содержащего ДНКазу (2 Ед/мл), и инкубируйте при температуре 37 °C с относительной влажностью ≥ 95% и 5%_CO2 в течение 15 мин. Осторожно переворачивайте пробирку каждые 3 минуты, чтобы способствовать диссоциации БЭ.
6. Как только БЭ перестанут быть видимыми или пройдет 15 минут, добавьте 6 мл KSR:N2 (1:1), содержащего ДНКазу (1 ЕД/мл), и центрифугируйте в течение 5 минут при 200 x g.
7. Пластинируйте клетки в KSR:N2 (1:1), содержащие LDN-193189 (250 нМ), XAV-939 (10 мкМ) и ингибитор ROCK Y-27632 (10 мкМ) при 4,5-5 x 10 4 кл/см².

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Эмбриональные фибробласты мыши (CF-1 MEF IRR 7M)	MTI-Globalstem	GSC-6101G	1 флакон 7М MEF достаточно для четырех 10-см пластин TC.
ФБС	Атланта Биолакс	S11150H
Примоцин	Инвивоген	Ант-пм-2	Также известен как противомикробное средство. Не фильтруйте с помощью основного фильтрующего материала - добавляйте после фильтрации.
N2 Добавка-B	Технологии стволовых клеток	7156	Не фильтруйте с помощью основного материала - добавляйте после фильтрации
Глутамакс (100x)	ТермоФишер	35050061	Также известен как L-аланин-L-глютамин.
Замена сыворотки KnockOut (KSR)	ТермоФишер	10828028	Также известна как безсывороточная средняя добавка.
L-глютамин (100x)	ТермоФишер	25030081
MEM-NEAA (100-кратный)	ТермоФишер	11140050
2-Меркаптоэтанол	ТермоФишер	21985023
Нокаут DMEM	ТермоФишер	10829018
Гиклон FBS	ВВР	82013-578	Также известен как FBS класса стволовых клеток.
Чашка для обработанной культурой тканей (10 см)	BD Falcon	353003
Неадгезивная стерильная чашка Петри (10см)	ВВР	25384-342 (Английский)
Фактор ингибирования лейкемии (mLIF)	Хемикон	ESG1107	Не замораживать, хранить при температуре 4'C.
DMEM/F12	ТермоФишер	11330032
0,1% раствор желатина	АТКС	АТКС ПКС-999-027
Ламинин	сигма	Л2020
Поли-L-лизин	сигма	П6282
Трипсин-ЭДТА (0,05%)	ТермоФишер	25300054
Аккутаза	ТермоФишер	A1110501	Также известен как реагент диссоциации клеток, не содержащий трипсин.
RQ1 РНКаза-свободная ДНКаза	Компания Promega	М610А
ЛДН-193189	Стемгент	04-1974	Ресуспендия в ДМСО и хранение при -80'C в одноразовых аликвотах
ХАВ939	Стемгент	04-1946	Ресуспендия в ДМСО и хранение при -80'C в одноразовых аликвотах
Ингибитор ROCK (Y-27632)	Токрис	1254	Ресуспендия в ДМСО и хранение при -80'C в одноразовых аликвотах